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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 表达载体构建
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wjw3188

木虫 (著名写手)

[求助] 表达载体构建

大家好，最近做表达出现了一点问题：首先，我将片段连接到T载体上，然后用相应酶（Bgl I 和Kpn I）酶切下来，回收后连接到载体pET-32a上，用T7引物PCR扩增，有目标条带，且单一明亮，可是提取质粒后，用同样的酶进行双酶切却切不开，不知道为什么？？？当初选择酶切位点的时候请教了别人，告诉我pET-32a上的酶切位点可以挨着，因为觉得保证载体的完整性会好一点，所以我就选择了两个挨着的酶切位点，现在切不开是不是因为这个，还是其他原因？求高手解答！！

[ 来自小组 Rose Family ]
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志存高远，方能展翅高飞
1楼 2013-06-17 21:45:02
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wjw3188(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-06-18 10:52:36
酶切位点相邻的确有可能降低切割效率，不过我认为不是这个问题。因为如果你做克隆时候能切开空的pET32a载体，说明即使这两个位点相邻也能够切开。而插入目的片段后两个位点已经不相邻了，切不下来可能是你的限制酶有问题。你试试用单酶切是否能切成线性分子，比较构建载体的大小是否比空载体大。你还可以试试换其他限制酶切。
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2楼2013-06-18 01:02:07
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wjw3188

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 冰风颤木 at 2013-06-20 11:05:44
楼主你说的问题 我也遇到了 建议你换了个酶切位点啊 我的一开始挨着也是切不开的啊。。。

换酶切位点是对的，为什么用原来的酶就切不开呢，很想知道为什么。
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志存高远，方能展翅高飞
8楼2013-06-29 11:26:29
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普通回帖

ivyvampire

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我也是，我怀疑是甲基化问题，但我的酶不应该甲基化的，我挑了20个，大多数都切不开，我已经重新连接转化了
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3楼2013-06-18 13:01:16
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冰风颤木

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主你说的问题 我也遇到了 建议你换了个酶切位点啊 我的一开始挨着也是切不开的啊。。。
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船到桥头自然直
4楼2013-06-20 11:05:44
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475502411

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wjw3188(myprayer代发): 金币+1, Gifts of roses, there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-29 13:33:48
首先你确定你的酶没问题
然后看看你扩增的片段的大小是不是你目的条带的大小，可以用特异性的引物试一试看能不能切开
如果都不行你就重新做一次吧
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可以朝九晚五，也能浪迹天涯
5楼2013-06-20 12:03:45
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wjw3188

木虫 (著名写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-07-17 16:37:55
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-18 01:02:07
酶切位点相邻的确有可能降低切割效率，不过我认为不是这个问题。因为如果你做克隆时候能切开空的pET32a载体，说明即使这两个位点相邻也能够切开。而插入目的片段后两个位点已经不相邻了，切不下来可能是你的限制酶有 ...

谢谢你的回复，我的酶没有问题，我把自然克隆至T载体上，能够切下来，连接到表达载体上，无论用特异引物还是载体通用引物，都能得到目标片段，用单酶切，大小也对，用载体上其他两个酶切位点进行双酶切，竟然也是对的！！！我真是不知所措了
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志存高远，方能展翅高飞
6楼2013-06-29 11:25:02
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wjw3188

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ivyvampire at 2013-06-18 13:01:16
我也是，我怀疑是甲基化问题，但我的酶不应该甲基化的，我挑了20个，大多数都切不开，我已经重新连接转化了

我已经重新做了一次，结果还是这样
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志存高远，方能展翅高飞
7楼2013-06-29 11:25:42
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wjw3188

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 475502411 at 2013-06-20 12:03:45
首先你确定你的酶没问题
然后看看你扩增的片段的大小是不是你目的条带的大小，可以用特异性的引物试一试看能不能切开
如果都不行你就重新做一次吧

酶没有问题，无论特异引物还是通用引物，大小都对。我准备测序验证了
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志存高远，方能展翅高飞
9楼2013-06-29 11:27:38
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冰风颤木

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by wjw3188 at 2013-06-29 11:26:29
换酶切位点是对的，为什么用原来的酶就切不开呢，很想知道为什么。...

我也是换了个酶切位点 主要是这两个之间的距离太近了。。。
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船到桥头自然直
10楼2013-06-29 12:32:53
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