应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 表达载体构建
141/2返回列表12下一页
查看: 1487  |  回复: 13
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

wjw3188

木虫 (著名写手)

[求助] 表达载体构建

大家好，最近做表达出现了一点问题：首先，我将片段连接到T载体上，然后用相应酶（Bgl I 和Kpn I）酶切下来，回收后连接到载体pET-32a上，用T7引物PCR扩增，有目标条带，且单一明亮，可是提取质粒后，用同样的酶进行双酶切却切不开，不知道为什么？？？当初选择酶切位点的时候请教了别人，告诉我pET-32a上的酶切位点可以挨着，因为觉得保证载体的完整性会好一点，所以我就选择了两个挨着的酶切位点，现在切不开是不是因为这个，还是其他原因？求高手解答！！

[ 来自小组 Rose Family ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
志存高远，方能展翅高飞
1楼 2013-06-17 21:45:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wjw3188(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-06-18 10:52:36
酶切位点相邻的确有可能降低切割效率，不过我认为不是这个问题。因为如果你做克隆时候能切开空的pET32a载体，说明即使这两个位点相邻也能够切开。而插入目的片段后两个位点已经不相邻了，切不下来可能是你的限制酶有问题。你试试用单酶切是否能切成线性分子，比较构建载体的大小是否比空载体大。你还可以试试换其他限制酶切。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2013-06-18 01:02:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wjw3188

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 冰风颤木 at 2013-06-20 11:05:44
楼主你说的问题 我也遇到了 建议你换了个酶切位点啊 我的一开始挨着也是切不开的啊。。。

换酶切位点是对的，为什么用原来的酶就切不开呢，很想知道为什么。
赞一下(1人) 回复此楼
志存高远，方能展翅高飞
8楼2013-06-29 11:26:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

ivyvampire

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我也是，我怀疑是甲基化问题，但我的酶不应该甲基化的，我挑了20个，大多数都切不开，我已经重新连接转化了
赞一下 回复此楼
3楼2013-06-18 13:01:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冰风颤木

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主你说的问题 我也遇到了 建议你换了个酶切位点啊 我的一开始挨着也是切不开的啊。。。
赞一下 回复此楼
船到桥头自然直
4楼2013-06-20 11:05:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

475502411

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wjw3188(myprayer代发): 金币+1, Gifts of roses, there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-29 13:33:48
首先你确定你的酶没问题
然后看看你扩增的片段的大小是不是你目的条带的大小，可以用特异性的引物试一试看能不能切开
如果都不行你就重新做一次吧
赞一下 回复此楼
可以朝九晚五，也能浪迹天涯
5楼2013-06-20 12:03:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wjw3188

木虫 (著名写手)
★ ★
gyesang: 金币+2, 鼓励回帖交流！ 2013-07-17 16:37:55
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-06-18 01:02:07
酶切位点相邻的确有可能降低切割效率，不过我认为不是这个问题。因为如果你做克隆时候能切开空的pET32a载体，说明即使这两个位点相邻也能够切开。而插入目的片段后两个位点已经不相邻了，切不下来可能是你的限制酶有 ...

谢谢你的回复，我的酶没有问题，我把自然克隆至T载体上，能够切下来，连接到表达载体上，无论用特异引物还是载体通用引物，都能得到目标片段，用单酶切，大小也对，用载体上其他两个酶切位点进行双酶切，竟然也是对的！！！我真是不知所措了
赞一下 回复此楼
志存高远，方能展翅高飞
6楼2013-06-29 11:25:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wjw3188

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ivyvampire at 2013-06-18 13:01:16
我也是，我怀疑是甲基化问题，但我的酶不应该甲基化的，我挑了20个，大多数都切不开，我已经重新连接转化了

我已经重新做了一次，结果还是这样
赞一下 回复此楼
志存高远，方能展翅高飞
7楼2013-06-29 11:25:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wjw3188

木虫 (著名写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 475502411 at 2013-06-20 12:03:45
首先你确定你的酶没问题
然后看看你扩增的片段的大小是不是你目的条带的大小，可以用特异性的引物试一试看能不能切开
如果都不行你就重新做一次吧

酶没有问题，无论特异引物还是通用引物，大小都对。我准备测序验证了
赞一下 回复此楼
志存高远，方能展翅高飞
9楼2013-06-29 11:27:38
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冰风颤木

金虫 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by wjw3188 at 2013-06-29 11:26:29
换酶切位点是对的，为什么用原来的酶就切不开呢，很想知道为什么。...

我也是换了个酶切位点 主要是这两个之间的距离太近了。。。
赞一下 回复此楼
船到桥头自然直
10楼2013-06-29 12:32:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 wjw3188 的主题更新
141/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 看来今天不会放榜了？ +5 chengyan1220 2026-08-21 5/250 2026-08-21 12:34 by gltch
[基金申请] 我面上完蛋了 +7 且听虎啸 2026-08-20 8/400 2026-08-21 12:31 by 酷酷墨镜
[基金申请] 只有每年这种时候来逛逛小木虫 +23 yaoyewhu2008 2026-08-20 25/1250 2026-08-21 12:19 by Poppy1104
[基金申请] 什么时候开奖？ +7 CrisMessi 2026-08-18 7/350 2026-08-21 12:15 by weiyin
[基金申请] 今天基金会出结果吗？20260819 +15 kkkl_v 2026-08-19 16/800 2026-08-21 11:22 by 365372687
[基金申请] 科研孤儿太难了 +15 我4大白菜 2026-08-20 16/800 2026-08-21 11:07 by yming1319
[基金申请] 应该是下周三26日公布了吧？ +4 哈哈蛤？ 2026-08-21 4/200 2026-08-21 10:58 by Vivilian
[论文投稿] 投稿咨询 +5 wwm09 2026-08-17 7/350 2026-08-21 10:11 by 期刊论文帮手
[基金申请] 今天放榜没戏了吧 +9 yuleib84 2026-08-19 11/550 2026-08-21 10:06 by gltch
[基金申请] 让我中一个面上吧！ +10 大萍1987 2026-08-20 12/600 2026-08-21 09:31 by 020100099
[基金申请] 今天系统多次维护，明天很可能放榜！ +10 zju2000 2026-08-16 11/550 2026-08-20 20:02 by cl479861084
[基金申请] 时间戳变了，能看出什么问题？ +18 基诺咪客 2026-08-17 23/1150 2026-08-20 17:19 by Godzela
[基金申请] 重要消息，中午系统在维护 +11 yuleib84 2026-08-18 12/600 2026-08-20 11:09 by xskun
[基金申请] filecode，4个jtjc了 +11 ziyangfang 2026-08-19 13/650 2026-08-19 21:28 by aasahr
[教师之家] 为什么余额宝的年化利率越来越低？主要原因有哪些？ +5 瞬息宇宙 2026-08-15 5/250 2026-08-19 20:23 by super2002521
[基金申请] 2027广东省杰青 +4 奶牛小黑 2026-08-15 10/500 2026-08-19 11:02 by wanfengnew
[基金申请] 今天维护系统维护 祝所有人 高中 +8 gjjjzhong 2026-08-18 9/450 2026-08-18 13:01 by 家与远方
[基金申请] 93BebMhtakh前后11位开头都是大写 +4 且听虎啸 2026-08-17 5/250 2026-08-18 00:49 by 蔡棒棒菂
[精细化工] 招聘 金属平磨液，抛光液研发工程师 +3 小天0311 2026-08-14 3/150 2026-08-16 07:31 by H9PLUS
[基金申请] 各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。 +7 Tide man 2026-08-14 8/400 2026-08-15 01:11 by arzu_hma
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭