应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 表达载体构建
51/1返回列表
查看: 1213  |  回复: 13
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

wjw3188

木虫 (著名写手)

[求助] 表达载体构建

大家好，最近做表达出现了一点问题：首先，我将片段连接到T载体上，然后用相应酶（Bgl I 和Kpn I）酶切下来，回收后连接到载体pET-32a上，用T7引物PCR扩增，有目标条带，且单一明亮，可是提取质粒后，用同样的酶进行双酶切却切不开，不知道为什么？？？当初选择酶切位点的时候请教了别人，告诉我pET-32a上的酶切位点可以挨着，因为觉得保证载体的完整性会好一点，所以我就选择了两个挨着的酶切位点，现在切不开是不是因为这个，还是其他原因？求高手解答！！

[ 来自小组 Rose Family ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
志存高远，方能展翅高飞
1楼2013-06-17 21:45:02
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

475502411

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wjw3188(myprayer代发): 金币+1, Gifts of roses, there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-29 13:33:48
首先你确定你的酶没问题
然后看看你扩增的片段的大小是不是你目的条带的大小，可以用特异性的引物试一试看能不能切开
如果都不行你就重新做一次吧
赞一下 回复此楼
可以朝九晚五，也能浪迹天涯
5楼2013-06-20 12:03:45
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 14 个回答

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wjw3188(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-06-18 10:52:36
酶切位点相邻的确有可能降低切割效率，不过我认为不是这个问题。因为如果你做克隆时候能切开空的pET32a载体，说明即使这两个位点相邻也能够切开。而插入目的片段后两个位点已经不相邻了，切不下来可能是你的限制酶有问题。你试试用单酶切是否能切成线性分子，比较构建载体的大小是否比空载体大。你还可以试试换其他限制酶切。
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2013-06-18 01:02:07
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ivyvampire

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我也是，我怀疑是甲基化问题，但我的酶不应该甲基化的，我挑了20个，大多数都切不开，我已经重新连接转化了
赞一下 回复此楼
3楼2013-06-18 13:01:16
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冰风颤木

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
楼主你说的问题 我也遇到了 建议你换了个酶切位点啊 我的一开始挨着也是切不开的啊。。。
赞一下 回复此楼
船到桥头自然直
4楼2013-06-20 11:05:44
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 14 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭