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wjw3188

木虫 (著名写手)

[求助] 表达载体构建

大家好,最近做表达出现了一点问题:首先,我将片段连接到T载体上,然后用相应酶(Bgl I 和Kpn I)酶切下来,回收后连接到载体pET-32a上,用T7引物PCR扩增,有目标条带,且单一明亮,可是提取质粒后,用同样的酶进行双酶切却切不开,不知道为什么???当初选择酶切位点的时候请教了别人,告诉我pET-32a上的酶切位点可以挨着,因为觉得保证载体的完整性会好一点,所以我就选择了两个挨着的酶切位点,现在切不开是不是因为这个,还是其他原因?求高手解答!!

[ 来自小组 Rose Family ]
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志存高远,方能展翅高飞
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冰风颤木

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
楼主你说的问题 我也遇到了 建议你换了个酶切位点啊 我的一开始挨着也是切不开的啊。。。
船到桥头自然直
4楼2013-06-20 11:05:44
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查看全部 14 个回答

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
wjw3188(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-06-18 10:52:36
酶切位点相邻的确有可能降低切割效率,不过我认为不是这个问题。因为如果你做克隆时候能切开空的pET32a载体,说明即使这两个位点相邻也能够切开。而插入目的片段后两个位点已经不相邻了,切不下来可能是你的限制酶有问题。你试试用单酶切是否能切成线性分子,比较构建载体的大小是否比空载体大。你还可以试试换其他限制酶切。
2楼2013-06-18 01:02:07
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ivyvampire

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我也是,我怀疑是甲基化问题,但我的酶不应该甲基化的,我挑了20个,大多数都切不开,我已经重新连接转化了
3楼2013-06-18 13:01:16
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475502411

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
wjw3188(myprayer代发): 金币+1, Gifts of roses, there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-29 13:33:48
首先你确定你的酶没问题
然后看看你扩增的片段的大小是不是你目的条带的大小,可以用特异性的引物试一试看能不能切开
如果都不行你就重新做一次吧
可以朝九晚五,也能浪迹天涯
5楼2013-06-20 12:03:45
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