24小时热门版块排行榜    

查看: 1339  |  回复: 13
当前只显示满足指定条件的回帖,点击这里查看本话题的所有回帖

wjw3188

木虫 (著名写手)

[求助] 表达载体构建

大家好,最近做表达出现了一点问题:首先,我将片段连接到T载体上,然后用相应酶(Bgl I 和Kpn I)酶切下来,回收后连接到载体pET-32a上,用T7引物PCR扩增,有目标条带,且单一明亮,可是提取质粒后,用同样的酶进行双酶切却切不开,不知道为什么???当初选择酶切位点的时候请教了别人,告诉我pET-32a上的酶切位点可以挨着,因为觉得保证载体的完整性会好一点,所以我就选择了两个挨着的酶切位点,现在切不开是不是因为这个,还是其他原因?求高手解答!!

[ 来自小组 Rose Family ]
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐,对您同样有帮助:

志存高远,方能展翅高飞
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ivyvampire

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我也是,我怀疑是甲基化问题,但我的酶不应该甲基化的,我挑了20个,大多数都切不开,我已经重新连接转化了
3楼2013-06-18 13:01:16
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 14 个回答

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
wjw3188(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-06-18 10:52:36
酶切位点相邻的确有可能降低切割效率,不过我认为不是这个问题。因为如果你做克隆时候能切开空的pET32a载体,说明即使这两个位点相邻也能够切开。而插入目的片段后两个位点已经不相邻了,切不下来可能是你的限制酶有问题。你试试用单酶切是否能切成线性分子,比较构建载体的大小是否比空载体大。你还可以试试换其他限制酶切。
2楼2013-06-18 01:02:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

冰风颤木

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
楼主你说的问题 我也遇到了 建议你换了个酶切位点啊 我的一开始挨着也是切不开的啊。。。
船到桥头自然直
4楼2013-06-20 11:05:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

475502411

铜虫 (著名写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
wjw3188(myprayer代发): 金币+1, Gifts of roses, there are lingering fragrance. Look forward to your wonderful and more detailed answer. 2013-06-29 13:33:48
首先你确定你的酶没问题
然后看看你扩增的片段的大小是不是你目的条带的大小,可以用特异性的引物试一试看能不能切开
如果都不行你就重新做一次吧
可以朝九晚五,也能浪迹天涯
5楼2013-06-20 12:03:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[考研] 312求调剂 +5 上岸吧ZJY 2026-03-22 8/400 2026-03-26 13:12 by 公瑾逍遥
[考研] 一志愿厦门大学化学学硕307求调剂 +3 y7czhao 2026-03-26 3/150 2026-03-26 10:23 by yeahyou
[考研] 调剂310 +3 温柔的晚安 2026-03-25 4/200 2026-03-25 23:16 by peike
[考研] 一志愿河工大 081700 276求调剂 +3 地球绕着太阳转 2026-03-23 3/150 2026-03-25 19:10 by 雾散后相遇lc
[考研] 求b区院校调剂 +4 周56 2026-03-24 5/250 2026-03-25 17:12 by yishunmin
[考研] 求调剂 +3 李李不服输 2026-03-25 3/150 2026-03-25 13:03 by cmz0325
[考研] 359求调剂 +3 王了个楠 2026-03-25 3/150 2026-03-25 12:50 by Dyhoer
[考研] 求调剂 一志愿 本科 北科大 化学 343 +4 13831862839 2026-03-24 5/250 2026-03-25 09:47 by 无际的草原
[考研] B区考研调剂 +4 yqdszhdap- 2026-03-22 5/250 2026-03-25 08:51 by baoball
[考研] 311求调剂 +3 冬十三 2026-03-24 3/150 2026-03-24 21:31 by peike
[考研] 材料专硕找调剂 +5 哈哈哈吼吼吼哈 2026-03-23 5/250 2026-03-24 19:07 by 了了了了。。
[考研] 279分求调剂 一志愿211 +18 chaojifeixia 2026-03-19 20/1000 2026-03-24 10:34 by dolphin_ycj
[考研] 环境学硕288求调剂 +8 皮皮皮123456 2026-03-22 8/400 2026-03-23 23:47 by 热情沙漠
[考研] 一志愿武理材料工程348求调剂 +6  ̄^ ̄゜汗 2026-03-19 9/450 2026-03-23 19:53 by pswait
[考研] 生物学一志愿985,分数349求调剂 +6 zxts12 2026-03-21 9/450 2026-03-23 18:37 by macy2011
[考研] 336化工调剂 +4 王大坦1 2026-03-23 5/250 2026-03-23 18:32 by allen-yin
[考研] 352求调剂 +3 大米饭! 2026-03-22 3/150 2026-03-22 23:28 by king123!
[考研] 一志愿中南化学(0703)总分337求调剂 +9 niko- 2026-03-19 10/500 2026-03-22 16:08 by ColorlessPI
[考研] 生物学调剂 +5 Surekei 2026-03-21 5/250 2026-03-22 14:39 by tcx007
[考研] 336求调剂 +5 rmc8866 2026-03-21 5/250 2026-03-21 17:24 by 学员8dgXkO
信息提示
请填处理意见