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16srDNA

铜虫 (初入文坛)

[求助] 如何做2个定点突变(2个终止密码子换掉)

读文献有几个问题不太懂,特向各位大神求助

有一段目的基因待表达 (支原体的一段基因,要在大肠杆菌中表达),表达前要把这段基因的2个终止密码子换掉,文献中用了3对引物(1对flanking region引物,2对含有mutation引物--每对引物都是overlap的),我的问题是这两个定点突变是怎么做的?

希望大神们帮帮忙,小女子拜谢
附上那篇文献
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木虫 (著名写手)


myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-06-16 10:43:05
少说了点,第一次突变引物退火搭上去延伸后直接用连接酶连接(引物应该是磷酸化的)。
个人觉得,这个方法步骤多,花费的时间也比较长。内切酶的酶切效果要求做得好,连接的效果也要做得好,有时候不太容易,因为我们拿到手的时候,酶的质量不够好。感受态效率要求应该还是比较高的。做多个点突变有困难,如果点是分开的,估计只好一次突变一个点,模板质粒选择来酶切筛选的唯一内切酶要来回变。
为什么
8楼2013-06-16 08:39:45
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sun_in_night

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
16srDNA(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-06-16 10:42:35
换终止密码子不用定点突变吧,直接克隆基因的时候,在你设计的引物上去掉终止密码子就行了呀。不是很懂的是为什么会有两个终止密码子?
2楼2013-06-15 21:05:49
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16srDNA

铜虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by sun_in_night at 2013-06-15 21:05:49
换终止密码子不用定点突变吧,直接克隆基因的时候,在你设计的引物上去掉终止密码子就行了呀。不是很懂的是为什么会有两个终止密码子?

谢谢你的回复。待表达的基因来自支原体,UGA在支原体中不是终止密码子,但是现在要克隆到pETHIS-1载体上在BL21中表达
3楼2013-06-15 21:23:56
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16srDNA

铜虫 (初入文坛)

我也不清楚这叫不叫定点突变,就是想把两个不同位置的终止密码子换掉,文献中给的两对引物是overlap的,但是文献中引用的文献9,我看不出有什么关联。。。

再附上文献9,求大神指导,小女子不胜感激

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  • 2013-06-15 21:35:59, 3.48 M
4楼2013-06-15 21:36:14
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