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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 如何做2个定点突变（2个终止密码子换掉）
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16srDNA

铜虫 (初入文坛)

[求助] 如何做2个定点突变（2个终止密码子换掉）

读文献有几个问题不太懂，特向各位大神求助

有一段目的基因待表达 (支原体的一段基因，要在大肠杆菌中表达），表达前要把这段基因的2个终止密码子换掉，文献中用了3对引物（1对flanking region引物，2对含有mutation引物--每对引物都是overlap的），我的问题是这两个定点突变是怎么做的？

希望大神们帮帮忙，小女子拜谢
附上那篇文献
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1楼 2013-06-15 18:53:01
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木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
16srDNA(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-06-16 10:42:46
引用回帖:
4楼: Originally posted by 16srDNA at 2013-06-15 21:36:14
我也不清楚这叫不叫定点突变，就是想把两个不同位置的终止密码子换掉，文献中给的两对引物是overlap的，但是文献中引用的文献9，我看不出有什么关联。。。

再附上文献9，求大神指导，小女子不胜感激

我说下我大概浏览后对图1突变方法的理解，，结合问题回答，看能不能帮助你解决你的问题。
为了把在大肠杆菌是终止密码子而在来源生物是翻译为谷氨酰胺的密码子TAA突变为CAA，美国TAA位置应该都会设计一条引物，另外在质粒其他有单一限制性内切酶识别位点的位置突变成另一种限制性内切酶。亲本质粒和突变引物变性退火延伸扩增。扩增产物用内切酶把退火成亲本质粒（没有搭上突变引物扩增的原始质粒）先切开，转化，切开的亲本质粒将不会复制，而一条链是亲本一条链是突变引物扩增的将会在繁殖扩增过程形成带有两条链相同的突变质粒或原始质粒。提取质粒，再次酶切，把原始质粒切开，留下突变质粒，再次转化，提取质粒，这次可以应该大多数是突变了的。再用突变形成的新内切酶位点进行鉴定。
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为什么
5楼2013-06-16 00:35:22
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木虫 (著名写手)
★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-06-16 10:43:05
少说了点，第一次突变引物退火搭上去延伸后直接用连接酶连接（引物应该是磷酸化的）。
个人觉得，这个方法步骤多，花费的时间也比较长。内切酶的酶切效果要求做得好，连接的效果也要做得好，有时候不太容易，因为我们拿到手的时候，酶的质量不够好。感受态效率要求应该还是比较高的。做多个点突变有困难，如果点是分开的，估计只好一次突变一个点，模板质粒选择来酶切筛选的唯一内切酶要来回变。
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为什么
8楼2013-06-16 08:39:45
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木虫 (著名写手)
楼主给的方法不是overlap，是引物搭上质粒单链模板再延伸、连接成环，再通过酶切减少背景和筛选鉴定。如果保证买到的试剂质量好，也是好方法。overlap和stratagene反向PCR法都是做突变比较常用的好方法。
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为什么
13楼2013-06-18 07:27:42
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