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ben7737873

铁虫 (初入文坛)

[求助] 求助质粒模板制备的最正确方法

各位前辈你们好,小弟构建了一个载体,后续需要做表达,有一个问题想咨询一下。
目前我已经构建好载体,测好序,保存了甘油目的菌,也提了一些质粒,够这段时间使用。
我想问一下,如果将来需要大量使用该质粒时,质粒用完的情况下,每次是用剩下的质粒模板转化感受态细胞,培养后小提质粒好,还是从-80度拿出菌种,划线,挑单克隆,过夜培养后小提质粒比较好?2种方法会不会导入不必要的突变?谢谢~~~
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
ben7737873: 金币+1, ★★★★★最佳答案 2013-01-15 09:04:59
都可以,如果你克隆的基因没有特殊的地方(如强毒性等),一般质粒会很稳定,在细菌内繁殖不太容易出现突变。
2楼2013-01-14 21:52:33
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ben7737873

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
2楼: Originally posted by 酶切专家 at 2013-01-14 21:52:33
都可以,如果你克隆的基因没有特殊的地方(如强毒性等),一般质粒会很稳定,在细菌内繁殖不太容易出现突变。

那再问您一个问题,我现在在做定点突变的实验,可以两个突变点的不同的质粒一起进行克隆吗?还是最好一个一个做克隆测序培养提质粒?其实就是想问问,菌液,质粒这些容易通过空气污染吗?和质粒大小有关吗?我的质粒加片段长8KB.谢谢
3楼2013-01-15 09:04:52
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dshlove

木虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by ben7737873 at 2013-01-15 09:04:52
那再问您一个问题,我现在在做定点突变的实验,可以两个突变点的不同的质粒一起进行克隆吗?还是最好一个一个做克隆测序培养提质粒?其实就是想问问,菌液,质粒这些容易通过空气污染吗?和质粒大小有关吗?我的质 ...

很明确的说两个突变点的不同的质粒一起进行不能一起克隆。两个突变点的不同的质粒就是两种不同的质粒了,要分开做克隆测序培养提质粒。

污染和质粒大小无关。再说了,也不是很容易污染,在你操作规范的前提下,再说了,构建的质粒都是有抗性的,就算有其他质粒空气中杂菌污染,在你加抗生素的时候都会死亡的。而且你提质粒时候是会用乙醇漂洗了,也能杀菌的。
4楼2013-01-15 10:32:26
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ben7737873

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
4楼: Originally posted by dshlove at 2013-01-15 10:32:26
很明确的说两个突变点的不同的质粒一起进行不能一起克隆。两个突变点的不同的质粒就是两种不同的质粒了,要分开做克隆测序培养提质粒。

污染和质粒大小无关。再说了,也不是很容易污染,在你操作规范的前提下, ...

我的意思不是2个质粒加一管菌液里培养,是说2个质粒2管菌液,但是比如同时操作啊,同时放摇床培养啊,这些空气中少量的质粒气体,会污染吗?是这个担心。谢谢你的关注啊,能回答下吗。
5楼2013-01-15 13:49:05
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dshlove

木虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by ben7737873 at 2013-01-15 13:49:05
我的意思不是2个质粒加一管菌液里培养,是说2个质粒2管菌液,但是比如同时操作啊,同时放摇床培养啊,这些空气中少量的质粒气体,会污染吗?是这个担心。谢谢你的关注啊,能回答下吗。...

这个是完全没问题的
当然你培养时候肯定更要扎上封口膜的,空气中是不会有质粒气体的,一般工程菌在没有培养基的情况下很难存活的。
6楼2013-01-15 13:54:25
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ben7737873

铁虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by dshlove at 2013-01-15 13:54:25
这个是完全没问题的
当然你培养时候肯定更要扎上封口膜的,空气中是不会有质粒气体的,一般工程菌在没有培养基的情况下很难存活的。...

明白,谢谢
7楼2013-01-15 13:58:40
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