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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 求助质粒模板制备的最正确方法
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ben7737873

铁虫 (初入文坛)

[求助] 求助质粒模板制备的最正确方法

各位前辈你们好，小弟构建了一个载体，后续需要做表达，有一个问题想咨询一下。
目前我已经构建好载体，测好序，保存了甘油目的菌，也提了一些质粒，够这段时间使用。
我想问一下，如果将来需要大量使用该质粒时，质粒用完的情况下，每次是用剩下的质粒模板转化感受态细胞，培养后小提质粒好，还是从-80度拿出菌种，划线，挑单克隆，过夜培养后小提质粒比较好？2种方法会不会导入不必要的突变？谢谢~~~
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1楼2013-01-14 17:29:08
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ben7737873

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 酶切专家 at 2013-01-14 21:52:33
都可以，如果你克隆的基因没有特殊的地方（如强毒性等），一般质粒会很稳定，在细菌内繁殖不太容易出现突变。

那再问您一个问题，我现在在做定点突变的实验，可以两个突变点的不同的质粒一起进行克隆吗？还是最好一个一个做克隆测序培养提质粒？其实就是想问问，菌液，质粒这些容易通过空气污染吗？和质粒大小有关吗？我的质粒加片段长8KB.谢谢
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3楼2013-01-15 09:04:52
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酶切专家

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
ben7737873: 金币+1, ★★★★★最佳答案 2013-01-15 09:04:59
都可以，如果你克隆的基因没有特殊的地方（如强毒性等），一般质粒会很稳定，在细菌内繁殖不太容易出现突变。
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2楼2013-01-14 21:52:33
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dshlove

木虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ben7737873 at 2013-01-15 09:04:52
那再问您一个问题，我现在在做定点突变的实验，可以两个突变点的不同的质粒一起进行克隆吗？还是最好一个一个做克隆测序培养提质粒？其实就是想问问，菌液，质粒这些容易通过空气污染吗？和质粒大小有关吗？我的质 ...

很明确的说两个突变点的不同的质粒一起进行不能一起克隆。两个突变点的不同的质粒就是两种不同的质粒了，要分开做克隆测序培养提质粒。

污染和质粒大小无关。再说了，也不是很容易污染，在你操作规范的前提下，再说了，构建的质粒都是有抗性的，就算有其他质粒空气中杂菌污染，在你加抗生素的时候都会死亡的。而且你提质粒时候是会用乙醇漂洗了，也能杀菌的。
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4楼2013-01-15 10:32:26
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ben7737873

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by dshlove at 2013-01-15 10:32:26
很明确的说两个突变点的不同的质粒一起进行不能一起克隆。两个突变点的不同的质粒就是两种不同的质粒了，要分开做克隆测序培养提质粒。

污染和质粒大小无关。再说了，也不是很容易污染，在你操作规范的前提下， ...

我的意思不是2个质粒加一管菌液里培养，是说2个质粒2管菌液，但是比如同时操作啊，同时放摇床培养啊，这些空气中少量的质粒气体，会污染吗？是这个担心。谢谢你的关注啊，能回答下吗。
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5楼2013-01-15 13:49:05
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