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snowch

新虫 (初入文坛)

[求助] 我做的定点突变一个位点，PCR无条带。。求高人指点。。

引物设计：
AAGAGTCCAGCAAGA/A/CTCGCCGACGTGGT
ACCACGTCGGCGAG/T/TCTTGCTGGACTCTT

GC%:56.67%,
Tm:61.13

50ul 反应体系：
    H2O:                                  37ul
    Buffer（10*）                     5ul
    引物（10uM each）            2ul
   dNTP                                    2ul
   质粒                                     1ul
   Taq                                      1ul

PCR程序：
        预变性   94°C   5min
        变性      94°C    30s
        退火      60°C     1min
       延伸       72°C     6min
       18循环
       延伸       72°C    10min

按道理说即使是没有突变，也应该能P出条带的啊，可是我都做了好久了还是没有任何进展，是引物设计的问题吗？跪求解决。。。。
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1楼 2012-12-15 00:53:50
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回帖置顶 ( 共有1个 )

pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2012-12-15 17:23:14
snowch: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-12-16 18:14:40
(1)如果做点突变实验，最好用pfu，尤其长度超过500bp,
(2)模板是质粒，最好用新抽提的，没有反复冻融过的，超螺旋DNA超过80%
（3）没有必要一定要看到电泳有带，可以在dpnI酶切一个小时后，取1—3微升做转化。
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行至水穷处，坐看云起时
2楼2012-12-15 16:43:12
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普通回帖

望海思月

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你可以用原始基因做一下PCR看看有没有条带，有可能是条件不合适
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3楼2012-12-15 16:59:42
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snowch

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2012-12-15 16:43:12
(1)如果做点突变实验，最好用pfu，尤其长度超过500bp,
(2)模板是质粒，最好用新抽提的，没有反复冻融过的，超螺旋DNA超过80%
（3）没有必要一定要看到电泳有带，可以在dpnI酶切一个小时后，取1—3微升做转化。

我倒是没有试过直接转化，我也听说过有人这么做，可是PCR要是成功的产物话，就应该是能有电泳条带的啊？中间是哪里出了问题的呢？
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4楼2012-12-16 00:28:21
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catmihzh

木虫 (小有名气)

虫虫特攻队队长
确实要用高保真酶，然后GC比有些高，可能要优化条件或者买专门的buffer或酶

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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[url=http://weibo.com/2152924384?s=6uyXnP][img]http://service.t.sina.com.cn/widget/qmd/2152924384/13d43368/7.png[/img][/url]
5楼2012-12-16 00:34:43
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drxiao2005

金虫 (小有名气)
从体系上看，好像没有两端的引物。如果只用突变引物肯定是扩不出任何东西。

可以参考1篇文章。Asymmetric overlap extension PCR method bypassing intermediate purification and the amplification of wild-type template in site-directed mutagenesis。Biotechnology Letters2007
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6楼2012-12-17 08:08:43
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zhlf1989513

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by snowch at 2012-12-16 00:28:21
我倒是没有试过直接转化，我也听说过有人这么做，可是PCR要是成功的产物话，就应该是能有电泳条带的啊？中间是哪里出了问题的呢？...

有时候核酸量比较少是看不到条带的。。。我们一般是酶切和酶连后直接转化，当然这应该是建立在你做过了很多次的基础上的，楼主可以试一下的。。。
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keepon
7楼2012-12-17 08:45:51
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肥宝

金虫 (小有名气)
我最近也在做定点突变。
1.用pfu
2.18个循环不够吧，我有一次P25个循环没P出来，30个就可以了。就算以前用Taq，我也至少25个循环。除非是做鉴定，可能不需要那么多循环数。否则产物量太少是不容易看见的。
3.引物浓度我是用20uM。
4.模板质粒浓度多少？我做过浓度太高，PCR效果也会不好。
5.我用的是TAKARA的高保真酶，不知道你用的是什么的。我自己试过做酶的不同buffer配方，不同的buffer结果会有不一样的。
6.你的退火温度可以再降点试试。
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8楼2012-12-17 09:24:49
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JAYWEN书生

银虫 (小有名气)
1.首先你的引物设计有问题，两条引物完全互补，直接无法扩增，因为直接自连了。
2.扩增的酶的话，用PfU或者更好是Phanta，taq不可能的，会出现更多的突变，让你解释不清
3.循环看你用的什么酶
4.引物浓度无关，就根据引物设计公司给你的要求配
5.可以交流
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9楼2014-01-02 15:16:40
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loveerobin

木虫 (职业作家)
不知道楼主的问题现在解决了没有
应该是四条引物吧
5端的上游引物和中间的下游引物扩增，反应物为1
3端的下游引物和中间的上游引物扩增，反应物为2
1和2混合，5端的上游引物和3端的下游引物，得到全长的，中间单位点突变序列

祝好运！
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10楼2014-01-02 15:29:36
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