应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 我做的定点突变一个位点，PCR无条带。。求高人指点。。
51/1返回列表
查看: 3057  |  回复: 9
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
本帖产生 1 个 MolEPI ，点击这里进行查看
当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖

snowch

新虫 (初入文坛)

[求助] 我做的定点突变一个位点，PCR无条带。。求高人指点。。

引物设计：
AAGAGTCCAGCAAGA/A/CTCGCCGACGTGGT
ACCACGTCGGCGAG/T/TCTTGCTGGACTCTT

GC%:56.67%,
Tm:61.13

50ul 反应体系：
    H2O:                                  37ul
    Buffer（10*）                     5ul
    引物（10uM each）            2ul
   dNTP                                    2ul
   质粒                                     1ul
   Taq                                      1ul

PCR程序：
        预变性   94°C   5min
        变性      94°C    30s
        退火      60°C     1min
       延伸       72°C     6min
       18循环
       延伸       72°C    10min

按道理说即使是没有突变，也应该能P出条带的啊，可是我都做了好久了还是没有任何进展，是引物设计的问题吗？跪求解决。。。。
回复此楼

» 收录本帖的淘帖专辑推荐

【分子生物】EPI帖

» 猜你喜欢

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-12-15 00:53:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

JAYWEN书生

银虫 (小有名气)
1.首先你的引物设计有问题，两条引物完全互补，直接无法扩增，因为直接自连了。
2.扩增的酶的话，用PfU或者更好是Phanta，taq不可能的，会出现更多的突变，让你解释不清
3.循环看你用的什么酶
4.引物浓度无关，就根据引物设计公司给你的要求配
5.可以交流
赞一下 回复此楼
9楼2014-01-02 15:16:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答

pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2012-12-15 17:23:14
snowch: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-12-16 18:14:40
(1)如果做点突变实验，最好用pfu，尤其长度超过500bp,
(2)模板是质粒，最好用新抽提的，没有反复冻融过的，超螺旋DNA超过80%
（3）没有必要一定要看到电泳有带，可以在dpnI酶切一个小时后，取1—3微升做转化。
赞一下(2人) 回复此楼
行至水穷处，坐看云起时
2楼2012-12-15 16:43:12
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

望海思月

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你可以用原始基因做一下PCR看看有没有条带，有可能是条件不合适
赞一下 回复此楼
3楼2012-12-15 16:59:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

snowch

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2012-12-15 16:43:12
(1)如果做点突变实验，最好用pfu，尤其长度超过500bp,
(2)模板是质粒，最好用新抽提的，没有反复冻融过的，超螺旋DNA超过80%
（3）没有必要一定要看到电泳有带，可以在dpnI酶切一个小时后，取1—3微升做转化。

我倒是没有试过直接转化，我也听说过有人这么做，可是PCR要是成功的产物话，就应该是能有电泳条带的啊？中间是哪里出了问题的呢？
赞一下 回复此楼
4楼2012-12-16 00:28:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
查看全部 10 个回答
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 mibUvS8DDCwf 2026-09-15 3/150 2026-09-16 23:28 by Tql5LQhh5rLK
[考研] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 vZfe6xYu34yj 2026-09-14 3/150 2026-09-16 22:26 by Tql5LQhh5rLK
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +4 Aj1rhIDL5ixY 2026-09-14 4/200 2026-09-16 22:16 by Tql5LQhh5rLK
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +3 23jxep3nCNZb 2026-09-14 3/150 2026-09-16 21:14 by MHf40yA0Uhyb
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +3 yaCh4X3wd045 2026-09-14 3/150 2026-09-16 20:39 by MHf40yA0Uhyb
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +8 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 9/450 2026-09-16 18:36 by rRvxEj3zorCy
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +4 6F5UbRU2I5hL 2026-09-14 4/200 2026-09-16 17:03 by i3KBRD19ERkG
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O54,科目全,可伽急 +5 s3fFTmArrBt6 2026-09-13 5/250 2026-09-16 15:51 by i3KBRD19ERkG
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8.O.551.O.5.4,科目全,可伽急 +4 s3fFTmArrBt6 2026-09-13 6/300 2026-09-16 03:50 by DgNGHc3h5tPl
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +7 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 7/350 2026-09-16 02:35 by DgNGHc3h5tPl
[找工作] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +7 QUjhNVAcOSff 2026-09-13 8/400 2026-09-16 02:23 by DgNGHc3h5tPl
[考博] 申博发邮件 +4 Lmengk 2026-09-15 4/200 2026-09-16 00:05 by 木心想继续深造
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8O.55.1.O.54,科目全,可伽急 +3 40ms4Wlo4umh 2026-09-14 3/150 2026-09-15 19:23 by CgyNCDVNhGVg
[找工作] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 23jxep3nCNZb 2026-09-14 3/150 2026-09-15 18:47 by CgyNCDVNhGVg
[考博] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 6F5UbRU2I5hL 2026-09-14 3/150 2026-09-15 17:39 by CgyNCDVNhGVg
[考博] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +7 s3fFTmArrBt6 2026-09-14 7/350 2026-09-15 16:23 by CgyNCDVNhGVg
[硕博家园] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +4 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 4/200 2026-09-15 14:34 by VMDqgnlKimtZ
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +4 6F5UbRU2I5hL 2026-09-14 4/200 2026-09-15 08:02 by C79jjtjAKjEn
[博后之家] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +6 3n8v2C8RimXI 2026-09-13 6/300 2026-09-15 05:50 by 5BDX0d0WFp7t
[公派出国] 售SCI-T0P文章，我:8O.5.5.1.O.54,科目齐全,可+急 +3 LwdutQ8HoqWP 2026-09-13 6/300 2026-09-14 22:37 by vZfe6xYu34yj
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭