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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 我做的定点突变一个位点，PCR无条带。。求高人指点。。
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snowch

新虫 (初入文坛)

[求助] 我做的定点突变一个位点，PCR无条带。。求高人指点。。

引物设计：
AAGAGTCCAGCAAGA/A/CTCGCCGACGTGGT
ACCACGTCGGCGAG/T/TCTTGCTGGACTCTT

GC%:56.67%,
Tm:61.13

50ul 反应体系：
    H2O:                                  37ul
    Buffer（10*）                     5ul
    引物（10uM each）            2ul
   dNTP                                    2ul
   质粒                                     1ul
   Taq                                      1ul

PCR程序：
        预变性   94°C   5min
        变性      94°C    30s
        退火      60°C     1min
       延伸       72°C     6min
       18循环
       延伸       72°C    10min

按道理说即使是没有突变，也应该能P出条带的啊，可是我都做了好久了还是没有任何进展，是引物设计的问题吗？跪求解决。。。。
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1楼 2012-12-15 00:53:50
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肥宝

金虫 (小有名气)
我最近也在做定点突变。
1.用pfu
2.18个循环不够吧，我有一次P25个循环没P出来，30个就可以了。就算以前用Taq，我也至少25个循环。除非是做鉴定，可能不需要那么多循环数。否则产物量太少是不容易看见的。
3.引物浓度我是用20uM。
4.模板质粒浓度多少？我做过浓度太高，PCR效果也会不好。
5.我用的是TAKARA的高保真酶，不知道你用的是什么的。我自己试过做酶的不同buffer配方，不同的buffer结果会有不一样的。
6.你的退火温度可以再降点试试。
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8楼2012-12-17 09:24:49
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+3, MolEPI+1, 鼓励积极发帖帮助解答问题。 2012-12-15 17:23:14
snowch: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-12-16 18:14:40
(1)如果做点突变实验，最好用pfu，尤其长度超过500bp,
(2)模板是质粒，最好用新抽提的，没有反复冻融过的，超螺旋DNA超过80%
（3）没有必要一定要看到电泳有带，可以在dpnI酶切一个小时后，取1—3微升做转化。
赞一下(2人) 回复此楼
行至水穷处，坐看云起时
2楼2012-12-15 16:43:12
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望海思月

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
你可以用原始基因做一下PCR看看有没有条带，有可能是条件不合适
赞一下 回复此楼
3楼2012-12-15 16:59:42
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snowch

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2012-12-15 16:43:12
(1)如果做点突变实验，最好用pfu，尤其长度超过500bp,
(2)模板是质粒，最好用新抽提的，没有反复冻融过的，超螺旋DNA超过80%
（3）没有必要一定要看到电泳有带，可以在dpnI酶切一个小时后，取1—3微升做转化。

我倒是没有试过直接转化，我也听说过有人这么做，可是PCR要是成功的产物话，就应该是能有电泳条带的啊？中间是哪里出了问题的呢？
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4楼2012-12-16 00:28:21
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