应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 定点突变，请教
71/1返回列表
查看: 1547  |  回复: 6
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

yulou2199

新虫 (小有名气)

[求助] 定点突变，请教

目的基因重组于PHEN 1载体，想对其中的几个位点进行定点饱和突变，通过设计一对互补引物，利用全质粒PCR+dpn 1消化能否实现，试剂盒一般用哪个公司？（实惠点的）
下面是我设计的针对其中一个位点的突变引物，是否可行？
5‘ CGCTTACGGCTTCTTTNNNTACTGGGGCCAAGG 3’
3‘ GCGAATGCCGAAGAAANNNATGACCCCGGTTCC 5’
DNASTAR引物分析：Length: 33, Tm: 73.8, GC%: 60.6
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)

» 本主题相关价值贴推荐，对您同样有帮助:
1楼 2012-12-13 10:31:39
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖置顶 ( 共有1个 )

pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+5, 鼓励发帖交流问题。 2012-12-13 19:53:49
amisking: 回帖置顶 2012-12-13 19:53:53
楼主是不是用的点突变试剂盒，里面有一个公式的，按照那个公式算>78度就可以，但是那个公式里面不配对的碱基是减的。

条件允许，买试剂盒做，条件不允许，自己买pfu, dpnI.

试剂盒Stratagene最先研发的，现在好像被安捷伦收购了，国内以前有个公司做过，就不在这里做广告了。
赞一下 回复此楼
行至水穷处，坐看云起时
3楼2012-12-13 14:32:28
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

带刺毛毛虫

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-12-13 19:53:41
最好是引物上设计好酶切位点，以质粒为模板定点突变只扩增目的片段，然后再从新连接载体上。聚合酶用高保真的
赞一下 回复此楼
加油
2楼2012-12-13 13:24:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yulou2199

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by pennchem at 2012-12-13 14:32:28
楼主是不是用的点突变试剂盒，里面有一个公式的，按照那个公式算>78度就可以，但是那个公式里面不配对的碱基是减的。

条件允许，买试剂盒做，条件不允许，自己买pfu, dpnI.

试剂盒Stratagene最先研发的，现 ...

是的，准备用定点突变试剂盒，在stratagene网站上设计得到的引物是：
5'-cttatttctgcgcttacggcttctttnnntactggggccaaggg-3'
3'-gaataaagacgcgaatgccgaagaaannnatgaccccggttccc-5'
Length (nt.)          Tm        Duplex Energy at 65°C        Energy Cost of Mismatches
44        78.91°C        -55.71 kcal/mole        9.1%

44bp是不是又点长，Tm>78是不是必须条件？请指教
赞一下 回复此楼
4楼2012-12-13 17:32:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

escapezrj

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
当时我做的时候也是用的试剂盒，感觉蛮轻松愉快的，按着protocol，然后一做就成功啦。
赞一下 回复此楼
5楼2012-12-13 19:43:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yandz680717

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
可以考虑用overlapping PCR
赞一下 回复此楼
6楼2012-12-13 20:15:00
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

Tm值高一些，当然更好，好像也不是非常的严格，有可能，尽量往上靠吧。

44bp长度还不是很极端，我见过更长也做出来的。

用这个方法，用新提取的DNA，提DNA的时候，尽可能的小心，碱裂解的时间不能太长，超螺旋的DNA含量超过80%非常关键。
赞一下 回复此楼
行至水穷处，坐看云起时
7楼2012-12-14 09:19:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 yulou2199 的主题更新
71/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭