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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 定点突变，请教
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yulou2199

新虫 (小有名气)

[求助] 定点突变，请教

目的基因重组于PHEN 1载体，想对其中的几个位点进行定点饱和突变，通过设计一对互补引物，利用全质粒PCR+dpn 1消化能否实现，试剂盒一般用哪个公司？（实惠点的）
下面是我设计的针对其中一个位点的突变引物，是否可行？
5‘ CGCTTACGGCTTCTTTNNNTACTGGGGCCAAGG 3’
3‘ GCGAATGCCGAAGAAANNNATGACCCCGGTTCC 5’
DNASTAR引物分析：Length: 33, Tm: 73.8, GC%: 60.6
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1楼 2012-12-13 10:31:39
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回帖置顶 ( 共有1个 )

pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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amisking: 金币+5, 鼓励发帖交流问题。 2012-12-13 19:53:49
amisking: 回帖置顶 2012-12-13 19:53:53
楼主是不是用的点突变试剂盒，里面有一个公式的，按照那个公式算>78度就可以，但是那个公式里面不配对的碱基是减的。

条件允许，买试剂盒做，条件不允许，自己买pfu, dpnI.

试剂盒Stratagene最先研发的，现在好像被安捷伦收购了，国内以前有个公司做过，就不在这里做广告了。
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行至水穷处，坐看云起时
3楼2012-12-13 14:32:28
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普通回帖

带刺毛毛虫

银虫 (小有名气)

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★ ★
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amisking: 金币+2, 鼓励发帖交流问题。 2012-12-13 19:53:41
最好是引物上设计好酶切位点，以质粒为模板定点突变只扩增目的片段，然后再从新连接载体上。聚合酶用高保真的
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加油
2楼2012-12-13 13:24:13
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yulou2199

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by pennchem at 2012-12-13 14:32:28
楼主是不是用的点突变试剂盒，里面有一个公式的，按照那个公式算>78度就可以，但是那个公式里面不配对的碱基是减的。

条件允许，买试剂盒做，条件不允许，自己买pfu, dpnI.

试剂盒Stratagene最先研发的，现 ...

是的，准备用定点突变试剂盒，在stratagene网站上设计得到的引物是：
5'-cttatttctgcgcttacggcttctttnnntactggggccaaggg-3'
3'-gaataaagacgcgaatgccgaagaaannnatgaccccggttccc-5'
Length (nt.)          Tm        Duplex Energy at 65°C        Energy Cost of Mismatches
44        78.91°C        -55.71 kcal/mole        9.1%

44bp是不是又点长，Tm>78是不是必须条件？请指教
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4楼2012-12-13 17:32:13
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escapezrj

铜虫 (初入文坛)

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当时我做的时候也是用的试剂盒，感觉蛮轻松愉快的，按着protocol，然后一做就成功啦。
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5楼2012-12-13 19:43:11
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yandz680717

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

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可以考虑用overlapping PCR
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6楼2012-12-13 20:15:00
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

Tm值高一些，当然更好，好像也不是非常的严格，有可能，尽量往上靠吧。

44bp长度还不是很极端，我见过更长也做出来的。

用这个方法，用新提取的DNA，提DNA的时候，尽可能的小心，碱裂解的时间不能太长，超螺旋的DNA含量超过80%非常关键。
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行至水穷处，坐看云起时
7楼2012-12-14 09:19:37
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