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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » α-淀粉酶基因表达问题
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xuyan_1215

新虫 (小有名气)

[求助] α-淀粉酶基因表达问题

各位虫友，本人最近在做α-淀粉酶基因的表达，遇到了如下问题：
(1)表达载体为PET-28a，表达宿主菌为BL21，外源基因已经通过测序验证连接到载体上了，检测酶活是发现，发酵液中有酶活但是胞内没有酶活，这是怎么回事呢？按理说应该是表达在胞内的呀?
(2)空白对照（JM109含有空载体）的发酵液中也有酶活？？？
ps：我都用IPTG诱导的，是不是说明菌种本身就能表达这种淀粉酶呢？
都要愁死了。。。
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1楼 2012-10-17 21:22:44
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gywyl1977

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
1)淀粉酶当然可以分泌到胞外。2）你查一下BL21的基因组序列，看看有没有淀粉酶基因，一般细菌都会有淀粉酶基因的。
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2楼2012-10-18 08:24:45
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xuyan_1215

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by gywyl1977 at 2012-10-18 08:24:45
1)淀粉酶当然可以分泌到胞外。2）你查一下BL21的基因组序列，看看有没有淀粉酶基因，一般细菌都会有淀粉酶基因的。

是否可以分泌到胞外是表达载体决定的还是本身的目的基因决定的呢？pET28是胞内表达型的载体啊。。。如果像BL21这样的通用型宿主都能表达淀粉酶的话，那我这个基因表达真就没办法做了呀。。。
求助。。。
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3楼2012-10-18 09:33:27
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gywyl1977

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-10-18 18:43:59
是否可以分泌到胞外是表达载体决定的还是本身的目的基因决定的呢？Re: 不是载体决定的，是由微生物本身是否有淀粉酶向胞转运系统决定的。
如果像BL21这样的通用型宿主都能表达淀粉酶的话，那我这个基因表达真就没办法做了呀。Re：你表达这个淀粉酶到底想做什么？否则没法给你建议啊。
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4楼2012-10-18 10:46:13
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xuyan_1215

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gywyl1977 at 2012-10-18 10:46:13
是否可以分泌到胞外是表达载体决定的还是本身的目的基因决定的呢？Re: 不是载体决定的，是由微生物本身是否有淀粉酶向胞转运系统决定的。
如果像BL21这样的通用型宿主都能表达淀粉酶的话，那我这个基因表达真就没办 ...

我是从微生物里面P出了淀粉酶的基因，然后连接到pET-28载体上进行表达，研究酶性质，并进行定点突变的，你看看有什么问题。
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5楼2012-10-18 19:29:36
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gywyl1977

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
xuyan_1215: 金币+5, ★★★很有帮助 2012-10-19 07:43:17
宿主菌胞内一点没有淀粉酶活力也说不过去，换其它E. coli试试。至于你说的宿主菌自生表达淀粉酶问题倒不大，毕竟酶蛋白的分子量不可能完全一样，可以分离的。
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6楼2012-10-18 21:24:13
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狐狸尾巴

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by gywyl1977 at 2012-10-18 10:46:13
是否可以分泌到胞外是表达载体决定的还是本身的目的基因决定的呢？Re: 不是载体决定的，是由微生物本身是否有淀粉酶向胞转运系统决定的。
如果像BL21这样的通用型宿主都能表达淀粉酶的话，那我这个基因表达真就没办 ...

载体也可以决定滴
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7楼2012-10-19 17:07:20
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xuyan_1215

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 狐狸尾巴 at 2012-10-19 17:07:20
载体也可以决定滴...

那我出现这样的状况到底说明是怎么回事呢？
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8楼2012-10-20 07:54:01
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