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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 如何做2个定点突变（2个终止密码子换掉）
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16srDNA

铜虫 (初入文坛)

[求助] 如何做2个定点突变（2个终止密码子换掉）

读文献有几个问题不太懂，特向各位大神求助

有一段目的基因待表达 (支原体的一段基因，要在大肠杆菌中表达），表达前要把这段基因的2个终止密码子换掉，文献中用了3对引物（1对flanking region引物，2对含有mutation引物--每对引物都是overlap的），我的问题是这两个定点突变是怎么做的？

希望大神们帮帮忙，小女子拜谢
附上那篇文献
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1楼 2013-06-15 18:53:01
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16srDNA

铜虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by sun_in_night at 2013-06-15 21:05:49
换终止密码子不用定点突变吧，直接克隆基因的时候，在你设计的引物上去掉终止密码子就行了呀。不是很懂的是为什么会有两个终止密码子？

谢谢你的回复。待表达的基因来自支原体，UGA在支原体中不是终止密码子，但是现在要克隆到pETHIS-1载体上在BL21中表达
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3楼2013-06-15 21:23:56
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sun_in_night

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
16srDNA(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-06-16 10:42:35
换终止密码子不用定点突变吧，直接克隆基因的时候，在你设计的引物上去掉终止密码子就行了呀。不是很懂的是为什么会有两个终止密码子？
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2楼2013-06-15 21:05:49
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16srDNA

铜虫 (初入文坛)
我也不清楚这叫不叫定点突变，就是想把两个不同位置的终止密码子换掉，文献中给的两对引物是overlap的，但是文献中引用的文献9，我看不出有什么关联。。。

再附上文献9，求大神指导，小女子不胜感激
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  • 附件 1 : PaperforQuestion9.pdf
    • 2013-06-15 21:35:59, 3.48 M
4楼2013-06-15 21:36:14
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547star

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
16srDNA(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。期待你的精彩和更详细的解答。 2013-06-16 10:42:46
引用回帖:
4楼: Originally posted by 16srDNA at 2013-06-15 21:36:14
我也不清楚这叫不叫定点突变，就是想把两个不同位置的终止密码子换掉，文献中给的两对引物是overlap的，但是文献中引用的文献9，我看不出有什么关联。。。

再附上文献9，求大神指导，小女子不胜感激

我说下我大概浏览后对图1突变方法的理解，，结合问题回答，看能不能帮助你解决你的问题。
为了把在大肠杆菌是终止密码子而在来源生物是翻译为谷氨酰胺的密码子TAA突变为CAA，美国TAA位置应该都会设计一条引物，另外在质粒其他有单一限制性内切酶识别位点的位置突变成另一种限制性内切酶。亲本质粒和突变引物变性退火延伸扩增。扩增产物用内切酶把退火成亲本质粒（没有搭上突变引物扩增的原始质粒）先切开，转化，切开的亲本质粒将不会复制，而一条链是亲本一条链是突变引物扩增的将会在繁殖扩增过程形成带有两条链相同的突变质粒或原始质粒。提取质粒，再次酶切，把原始质粒切开，留下突变质粒，再次转化，提取质粒，这次可以应该大多数是突变了的。再用突变形成的新内切酶位点进行鉴定。
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为什么
5楼2013-06-16 00:35:22
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