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关于双酶切后回收的问题
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各位大神 我最近在做原核表达。我的蛋白编码基因大小大约只有300bp，用带酶切位点的引物p出来后连19T载体测序正确。然后用Bam HI和Hind III这两种酶切3小时。但是酶切完每次跑电泳下来切下来的T载体的条带特别亮，但是目的片段特别暗，几条带一起回收都回收不出来东西。实在很郁闷。是不是因为我的目的片段相对于T载体太小了？有什么办法能解决么？ 或者我能不能直接从含T载体的大肠杆菌菌液里pcr出目的片段直接双酶切？ 希望各位赐教哈 |
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9楼2013-05-27 17:39:12
【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
summermio(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-29 19:12:37
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summermio(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-29 19:12:37
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我跟你一样，我跑的两个片段切下一个310，一个259.连的是18T。一开始怎么都看不到，然后大量切才一点点，然后回收率低的想哭。浪费时间啊。。你看，3ug就要切60ul上样的时候就要大孔，这样就要切多的胶。损失率高啊。 后来我思考了一个办法，发现很好用。我是用PCR机酶切的，切完以后开PCR机盖子，开pcr管盖子，设定到70度，蒸它1个小时。然后体积就从60变成30了。然后你做3管这样的，可以更狠一点，直接蒸到15ul一管。然后45ul用一个大孔跑。包你切到漂漂亮亮的。。 不过其实我用之前那种很多一起跑，最后胶回收的时候全部浓缩到一个管里面，30ul。出来的浓度有2ng/ul。也能跟5900bp的表达载体连接。 |
10楼2013-05-27 23:40:26
12楼2013-05-31 13:02:52
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