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summermio

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于双酶切后回收的问题

各位大神
我最近在做原核表达。我的蛋白编码基因大小大约只有300bp,用带酶切位点的引物p出来后连19T载体测序正确。然后用Bam HI和Hind III这两种酶切3小时。但是酶切完每次跑电泳下来切下来的T载体的条带特别亮,但是目的片段特别暗,几条带一起回收都回收不出来东西。实在很郁闷。是不是因为我的目的片段相对于T载体太小了?有什么办法能解决么?

或者我能不能直接从含T载体的大肠杆菌菌液里pcr出目的片段直接双酶切?
希望各位赐教哈
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summermio

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
11楼: Originally posted by m_marion at 2013-05-28 00:01:45
才300bp,当然直接用高保真酶PCR后酶切,反正你后面拼好还是要测序的。

我用Takara PrimerSTAR对4~6Kbp的整个质粒作PCR作过多次,从没出过突变,你要是担心实验进度,顶多是PCR酶切连接后挑两个长度检测正确的样 ...

多谢。我在实验室的情况比较特殊,不能直接向领导要求买酶的。= =
只好用taq酶p了片段酶切转化后取菌液pcr了一下看上去也初步正确。送了5管测序,但愿有对的吧。
12楼2013-05-31 13:02:52
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stevenshi021

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
summermio(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香,感谢你的慷慨解囊,期待你的精彩。 2013-05-26 13:29:00
你当然可以直接PCR扩增,虽然那个可能会有引入突变的风险(当然比较小)。至于亮度的问题是因为其条带小,亮度是与DNA量成正比的。你的载体与小片段如果酶切完全,其亮度比例应该是与其DNA长度比例一致。
2楼2013-05-26 06:13:38
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j134104

金虫 (小有名气)

完全赞成2楼。一般我们就是这样做的

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
3楼2013-05-26 08:32:08
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与,应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2013-05-27 10:34:25
300bp的PCR出错的概率不大。但我认为完全没有必要再做PCR。酶切后电泳条带不亮是因为片段小。你可以适当增加酶切时的质粒用量就可以了。你可以估算一下,切5μg质粒,才能有大致0.5μg的目的片段出来。再加上切胶回收会有一些损失,最后的产率可想而知了。虽然连接需要的DNA量很少,但为了保证回收片段的浓度,我认为你至少需要切5-10μg的质粒。
4楼2013-05-26 15:05:35
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