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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于双酶切后回收的问题
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m_marion

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-29 19:12:48
才300bp，当然直接用高保真酶PCR后酶切，反正你后面拼好还是要测序的。

我用Takara PrimerSTAR对4~6Kbp的整个质粒作PCR作过多次，从没出过突变，你要是担心实验进度，顶多是PCR酶切连接后挑两个长度检测正确的样送测序，300bp的话，几乎肯定至少有一个是正确的。


另外用高保真酶作合成用途（而不是TaqE检测用途）的话，模版尽量干净点，用质粒抽提得到的质粒作模版吧，别直接作菌液PCR。
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11楼2013-05-28 00:01:45
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summermio

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by m_marion at 2013-05-28 00:01:45
才300bp，当然直接用高保真酶PCR后酶切，反正你后面拼好还是要测序的。

我用Takara PrimerSTAR对4~6Kbp的整个质粒作PCR作过多次，从没出过突变，你要是担心实验进度，顶多是PCR酶切连接后挑两个长度检测正确的样 ...

多谢。我在实验室的情况比较特殊，不能直接向领导要求买酶的。＝　＝
只好用ｔａｑ酶ｐ了片段酶切转化后取菌液ｐｃｒ了一下看上去也初步正确。送了５管测序，但愿有对的吧。
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12楼2013-05-31 13:02:52
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summermio

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
6楼: Originally posted by chyanqiu at 2013-05-27 14:49:54
如果你坚持用酶切的方法，我建议用高浓度的胶。在高浓度胶中，300bp的迁移率不是很快，我用这种方法回收150bp片段的

我用的是２％的胶。酶切体系２０ｕｌ切两管一切回收浓度也只有５，不过基本够用了哈，不过当然没有ｐｃｒ产物酶切回首那个量看起来爽啊。。
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13楼2013-05-31 13:19:55
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