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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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m_marion

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助! 2013-05-29 19:12:48
才300bp,当然直接用高保真酶PCR后酶切,反正你后面拼好还是要测序的。

我用Takara PrimerSTAR对4~6Kbp的整个质粒作PCR作过多次,从没出过突变,你要是担心实验进度,顶多是PCR酶切连接后挑两个长度检测正确的样送测序,300bp的话,几乎肯定至少有一个是正确的。


另外用高保真酶作合成用途(而不是TaqE检测用途)的话,模版尽量干净点,用质粒抽提得到的质粒作模版吧,别直接作菌液PCR。
11楼2013-05-28 00:01:45
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summermio

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
11楼: Originally posted by m_marion at 2013-05-28 00:01:45
才300bp,当然直接用高保真酶PCR后酶切,反正你后面拼好还是要测序的。

我用Takara PrimerSTAR对4~6Kbp的整个质粒作PCR作过多次,从没出过突变,你要是担心实验进度,顶多是PCR酶切连接后挑两个长度检测正确的样 ...

多谢。我在实验室的情况比较特殊,不能直接向领导要求买酶的。= =
只好用taq酶p了片段酶切转化后取菌液pcr了一下看上去也初步正确。送了5管测序,但愿有对的吧。
12楼2013-05-31 13:02:52
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summermio

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
6楼: Originally posted by chyanqiu at 2013-05-27 14:49:54
如果你坚持用酶切的方法,我建议用高浓度的胶。在高浓度胶中,300bp的迁移率不是很快,我用这种方法回收150bp片段的

我用的是2%的胶。酶切体系20ul切两管一切回收浓度也只有5,不过基本够用了哈,不过当然没有pcr产物酶切回首那个量看起来爽啊。。
13楼2013-05-31 13:19:55
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