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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于双酶切后回收的问题
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summermio

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于双酶切后回收的问题

各位大神
我最近在做原核表达。我的蛋白编码基因大小大约只有300bp，用带酶切位点的引物p出来后连19T载体测序正确。然后用Bam HI和Hind III这两种酶切3小时。但是酶切完每次跑电泳下来切下来的T载体的条带特别亮，但是目的片段特别暗，几条带一起回收都回收不出来东西。实在很郁闷。是不是因为我的目的片段相对于T载体太小了？有什么办法能解决么？

或者我能不能直接从含T载体的大肠杆菌菌液里pcr出目的片段直接双酶切？
希望各位赐教哈
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1楼 2013-05-25 20:49:13
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m_marion

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-29 19:12:48
才300bp，当然直接用高保真酶PCR后酶切，反正你后面拼好还是要测序的。

我用Takara PrimerSTAR对4~6Kbp的整个质粒作PCR作过多次，从没出过突变，你要是担心实验进度，顶多是PCR酶切连接后挑两个长度检测正确的样送测序，300bp的话，几乎肯定至少有一个是正确的。


另外用高保真酶作合成用途（而不是TaqE检测用途）的话，模版尽量干净点，用质粒抽提得到的质粒作模版吧，别直接作菌液PCR。
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11楼2013-05-28 00:01:45
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stevenshi021

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
summermio(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-26 13:29:00
你当然可以直接PCR扩增，虽然那个可能会有引入突变的风险（当然比较小）。至于亮度的问题是因为其条带小，亮度是与DNA量成正比的。你的载体与小片段如果酶切完全，其亮度比例应该是与其DNA长度比例一致。
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2楼2013-05-26 06:13:38
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j134104

金虫 (小有名气)
完全赞成2楼。一般我们就是这样做的

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2013-05-26 08:32:08
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2013-05-27 10:34:25
300bp的PCR出错的概率不大。但我认为完全没有必要再做PCR。酶切后电泳条带不亮是因为片段小。你可以适当增加酶切时的质粒用量就可以了。你可以估算一下，切5μg质粒，才能有大致0.5μg的目的片段出来。再加上切胶回收会有一些损失，最后的产率可想而知了。虽然连接需要的DNA量很少，但为了保证回收片段的浓度，我认为你至少需要切5-10μg的质粒。
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4楼2013-05-26 15:05:35
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