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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于双酶切后回收的问题
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summermio

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于双酶切后回收的问题

各位大神
我最近在做原核表达。我的蛋白编码基因大小大约只有300bp，用带酶切位点的引物p出来后连19T载体测序正确。然后用Bam HI和Hind III这两种酶切3小时。但是酶切完每次跑电泳下来切下来的T载体的条带特别亮，但是目的片段特别暗，几条带一起回收都回收不出来东西。实在很郁闷。是不是因为我的目的片段相对于T载体太小了？有什么办法能解决么？

或者我能不能直接从含T载体的大肠杆菌菌液里pcr出目的片段直接双酶切？
希望各位赐教哈
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1楼2013-05-25 20:49:13
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xjtu0025

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
summermio(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-29 19:12:37
我跟你一样，我跑的两个片段切下一个310，一个259.连的是18T。一开始怎么都看不到，然后大量切才一点点，然后回收率低的想哭。浪费时间啊。。你看，3ug就要切60ul上样的时候就要大孔，这样就要切多的胶。损失率高啊。

后来我思考了一个办法，发现很好用。我是用PCR机酶切的，切完以后开PCR机盖子，开pcr管盖子，设定到70度，蒸它1个小时。然后体积就从60变成30了。然后你做3管这样的，可以更狠一点，直接蒸到15ul一管。然后45ul用一个大孔跑。包你切到漂漂亮亮的。。

不过其实我用之前那种很多一起跑，最后胶回收的时候全部浓缩到一个管里面，30ul。出来的浓度有2ng/ul。也能跟5900bp的表达载体连接。
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10楼2013-05-27 23:40:26
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stevenshi021

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
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summermio(myprayer代发): 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，感谢你的慷慨解囊，期待你的精彩。 2013-05-26 13:29:00
你当然可以直接PCR扩增，虽然那个可能会有引入突变的风险（当然比较小）。至于亮度的问题是因为其条带小，亮度是与DNA量成正比的。你的载体与小片段如果酶切完全，其亮度比例应该是与其DNA长度比例一致。
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2楼2013-05-26 06:13:38
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j134104

金虫 (小有名气)
完全赞成2楼。一般我们就是这样做的

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
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3楼2013-05-26 08:32:08
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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小丹木木: 金币+3, 鼓励应助 2013-05-27 10:34:25
300bp的PCR出错的概率不大。但我认为完全没有必要再做PCR。酶切后电泳条带不亮是因为片段小。你可以适当增加酶切时的质粒用量就可以了。你可以估算一下，切5μg质粒，才能有大致0.5μg的目的片段出来。再加上切胶回收会有一些损失，最后的产率可想而知了。虽然连接需要的DNA量很少，但为了保证回收片段的浓度，我认为你至少需要切5-10μg的质粒。
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4楼2013-05-26 15:05:35
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