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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白破碎后，上清的活性很低
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hraikeyan

金虫 (小有名气)

[求助] 蛋白破碎后，上清的活性很低

各位好心人，我最近在做蛋白表达。全细胞的酶活很高，用超声破碎后，破碎后上清活性很低，但沉淀的活性很高。蛋白电泳结果也是一样的，上清的条带很暗，沉淀很粗。我想应该是破碎不完全吧。我的破碎条件是这样的：破碎1s，暂停2s。总共这样循环破1h，功率45%。
各位做蛋白表达的同志们，能否给我些建议，我想我这应该不是形成包涵体吧，但是都破碎了1h了，沉淀中还是有好多目的蛋白。
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nothing isimpossible
1楼 2013-05-07 21:25:02
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

roomofxw

木虫 (正式写手)
★
hraikeyan(gyesang代发): 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-09 20:57:40
引用回帖:
8楼: Originally posted by hraikeyan at 2013-05-08 10:34:37
您好：破碎时，如果菌浓度稍高，是不是不好啊。...

菌体浓度不应该高了，不利于破碎。另外超声探头的磨损情况之类，多听听声音，不应该是沉闷的声音，很尖利才是。
不过也不能否定去测包涵体有活性，只不过这种情况很少，是酶的话就可能性小了
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9楼2013-05-08 10:52:48
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。同样期待你更详细的应助指导。 2013-05-08 09:11:58
"蛋白电泳结果也是一样的，上清的条带很暗，沉淀很粗。"应该是形成了包涵体。但沉淀的活性很高，说明沉淀里有很多目的蛋白质不是包涵体，因为包涵体是变性的聚集体，一般为固体形态，没有生物活性。
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2楼2013-05-07 21:55:22
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

我想可能是酶与某些其他成分形成了共聚物，但是没有聚集成为固体状态，或者说类似于固定化酶的形态，所以目的酶还是有生物活性。
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3楼2013-05-07 21:57:30
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。同样期待你更详细的应助指导。 2013-05-08 09:12:08
既然不清楚“固定化”酶本身与非酶的介质之间的链接到底是什么？那么可以先用破坏非共价键的把“固定化”酶从介质上解脱下来。比如用加入一些表面活性剂破坏“固定化”酶本身与非酶的介质之间的疏水相互作用，然后离心试试看。比如可以用低浓度的去污剂(浓度不大于2%的Triton X-100或浓度不大于0.5%SDS)洗涤样品（上样洗脱时）；增加洗脱液的盐浓度（氯化钠溶液低于2mol/L）；上样液里加入30%-50%的甘油，已减弱疏水相互作用，然后过层析住加以分离；或者用硫酸铵沉淀蛋白质-----分离蛋白质与生物大分子，而后除去硫酸铵再用用层析；如果酶石墨蛋白质则可用丙酮分级分离；另外疏水层析和离子交换树脂也可以用上；实在分离不开就用SDS-PAGE电泳分离，然后回收凝胶中 的蛋白质再进行复性。

　　
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4楼2013-05-07 22:09:57
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

就是一般蛋白质的分离程序：粉碎细胞，离心，盐析，有机试剂沉淀。后是离子交换层析，疏水层析，电泳，分子筛层析，亲和层系等。
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5楼2013-05-07 22:21:55
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

如果真的有些目的酶与别的生物大分子形成了共价化合物，除非实验经费充足，否则还是丢弃算了，你把这些酶的共价修饰去掉，还不如重新表达省开支吶。
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6楼2013-05-07 22:24:37
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roomofxw

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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myprayer: 赠人玫瑰手有余香。期待你的慷慨解囊。快乐每一天鼓励虫子来到生物版块交流，期待你的精彩1 2013-05-08 09:12:18
hraikeyan: 金币+3, ★★★很有帮助 2013-05-08 10:33:59
包涵体还能有功能的很少见的
沉淀重悬以后，再分别电泳看看是不是能有蛋白溶出来了
破菌比，超声操作不好的话，破不开也没什么奇怪的
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7楼2013-05-08 09:06:01
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by roomofxw at 2013-05-08 09:06:01
包涵体还能有功能的很少见的
沉淀重悬以后，再分别电泳看看是不是能有蛋白溶出来了
破菌比，超声操作不好的话，破不开也没什么奇怪的

您好：破碎时，如果菌浓度稍高，是不是不好啊。
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nothing isimpossible
8楼2013-05-08 10:34:37
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

包涵体的理解上可能各有差异，不过包涵体一般是是指原核表达系统过量和非正确折叠表达后形成的固体颗粒，此时包涵体状态的酶多数在固体的内层无法接触底物和水溶液，刚谈不上底物通道。即使在固体表面的酶也因为其构象被固定而无法与底物形成诱导契合的构象变化，所以不可能有活性！
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10楼2013-05-08 11:20:56
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