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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白破碎后，上清的活性很低
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roomofxw

木虫 (正式写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-05-08 11:20:56
包涵体的理解上可能各有差异，不过包涵体一般是是指原核表达系统过量和非正确折叠表达后形成的固体颗粒，此时包涵体状态的酶多数在固体的内层无法接触底物和水溶液，刚谈不上底物通道。即使在固体表面的酶也因为其构 ...

Inclusion bodies:a new concept
microbial cell factories,2010,9:80
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11楼2013-05-08 13:08:18
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
Inclusion bodies:a new concept ???microbial cell factories,2010,9:80有多少看过？

我告诉你：Inclusion bodies用于病毒是指病毒感染的特定区域！！
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12楼2013-05-08 13:18:27
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)
http://labs.fhcrc.org/strong/StrongLabRefoldingProtocol.pdf 这篇文献引用的Inclusion bodies就是我说的概念。

楼上说的是 http://www.microbialcellfactorie ... /1475-2859-9-80.pdf
这个概念我不认为已经被广泛接受。
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13楼2013-05-08 13:23:10
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

粉碎细胞时的沉淀当然可能是有活性的，但是形成固体颗粒状的包涵体肯定没有生物活性。我说的是固体颗粒的蛋白质异常折叠盒凝聚物是没有生物活性。至于一个概念的提出是否会被广泛接受与其被提出的时间没有直接关联，首先是其内涵是否明确和界限分明即有实用性，我不排除Inclusion bodies用于蛋白质折叠领域会更新，但是仅仅凭一篇文献就认为某概念被广泛接受是不适当的，一般而言，一个成熟的被广泛接受的概念应该出现在国际流行的大学本科和研究生的专业教材中，或者在SCI文献中广泛地被使用。
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14楼2013-05-08 13:33:26
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hraikeyan

金虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by roomofxw at 2013-05-08 10:52:48
菌体浓度不应该高了，不利于破碎。另外超声探头的磨损情况之类，多听听声音，不应该是沉闷的声音，很尖利才是。
不过也不能否定去测包涵体有活性，只不过这种情况很少，是酶的话就可能性小了...

你们破碎时，是用什么溶菌的，我是用磷酸缓冲液溶收集的菌体，然后直接破碎的，是不是应该有专门的破菌缓冲液。
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nothing isimpossible
15楼2013-05-08 13:47:42
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roomofxw

木虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-05-08 13:33:26
粉碎细胞时的沉淀当然可能是有活性的，但是形成固体颗粒状的包涵体肯定没有生物活性。我说的是固体颗粒的蛋白质异常折叠盒凝聚物是没有生物活性。至于一个概念的提出是否会被广泛接受与其被提出的时间没有直接关联， ...

定义的范围不一样罢了
你指的是严格意义的包涵体
我指的只是破碎细胞的沉淀蛋白
当然这种现象不只一两篇文献
例如，淀粉样蛋白正确情况就会产生聚集开始沉淀，而标记抗体的藻胆蛋白形成沉淀也依然发荧光，趋化因子系列蛋白我也正在探索。
它们可能不涉及二硫键错配，结构大量折叠错误，仅仅是蛋白结构的特性导致松散的聚集在一起，通过缓冲液的改变，或者就是测活缓冲液环境的不同，就解离复溶了。
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16楼2013-05-09 09:10:19
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

你与怎么理解包涵体是你的事情，但是蛋白质形成固体颗粒是肯定没有生物活性的！！但是仅仅一篇名无名的文献没有价值！固定化酶是有生物活性的！
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17楼2013-05-09 11:11:14
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

蛋白质的晶体一般是有生物活性的，因为蛋白质的晶体含有相当质量比例的水，完全失去水蛋白质晶体一般会变为粉末，但是没有说这是包涵体。如果非要说包涵体不是那种原核基因表达产生的异常蛋白质折叠引起的固体的没有生物活性的颗粒，那木这种原有概念又该用什么概念加以代替那！！？？仅仅凭借一篇无名的文献就说包涵体有活性，那没有活性的异常蛋白质折叠引起的固体的没有生物活性的颗粒又怎么算！！？？这算是概念严谨吗！！？？难道CNS没有大量支持“包涵体是那种原核基因表达产生的异常蛋白质折叠引起的固体的没有生物活性的颗粒”的概念吗？？？谁能证明那种原核基因表达产生的异常蛋白质折叠引起的固体在水相中是有生物活性的？？？相反的证据倒是有不少！
一个科学的概念提出的时间与其存在的价值有必然联系吗？？现在又有谁能推翻达尔文进化论和爱因斯坦相对论？？有很多人试图这样做过。当然任何理论都有其使用范围，但是正确与错误不可能是因为时间变为一致。
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18楼2013-05-09 11:31:55
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

在变性包涵体使其溶解或把沉淀的生物大分子复合体溶解过程中切断二硫键也是必要的，要使用DTT或巯基乙醇。但是如果有(His)6标签要过Ni2+-NTA树脂亲和层析柱，必须要在过柱前用超滤和透析把DTT去掉DTT大于1mmol/L会还原Ni2+离子导致挂柱失败，巯基乙醇留下可以减少由于二硫键形成的交联蛋白质引起的污染。
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19楼2013-05-09 11:42:29
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roomofxw

木虫 (正式写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-05-09 11:31:55
蛋白质的晶体一般是有生物活性的，因为蛋白质的晶体含有相当质量比例的水，完全失去水蛋白质晶体一般会变为粉末，但是没有说这是包涵体。如果非要说包涵体不是那种原核基因表达产生的异常蛋白质折叠引起的固体的没有 ...

那些既沉淀，还能表现活性的蛋白，叫什么呢？既然觉得文献不可信，没关系啊，我做点实验重复重复文献中提到的几种重组蛋白，再来汇报就是了。
肯定不止一篇文献啊，中英文相关报道都有的，我从引用中反查最早的一篇1989年报道酶的，当然我下不到全文，有兴趣查阅一下
The formation of biologically active beta-galactosidase inclusion bodies in Escherichia coli.
Culture conditions affecting the formation of beta-galactosidase inclusion bodies in E. coli were examined. High temperature, early induction, high salt concentration and low aeration were all found to favour an increase of insoluble beta-galactosidase and the formation of visible inclusion bodies. The ratio of soluble to insoluble beta-galactosidase decreased during the course of cell growth. When assayed for beta-galactosidase activity, the inclusion bodies were enzymatically active with a specific activity of one third that of soluble beta-galactosidase. The activity remained associated with the inclusion bodies on washing with detergent and high ionic strength buffers. These results suggest that inclusion bodies can contain correctly folded protein.
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20楼2013-05-10 09:21:18
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