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蛋白破碎后，上清的活性很低
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各位好心人，我最近在做蛋白表达。全细胞的酶活很高，用超声破碎后，破碎后上清活性很低，但沉淀的活性很高。蛋白电泳结果也是一样的，上清的条带很暗，沉淀很粗。我想应该是破碎不完全吧。我的破碎条件是这样的：破碎1s，暂停2s。总共这样循环破1h，功率45%。 各位做蛋白表达的同志们，能否给我些建议，我想我这应该不是形成包涵体吧，但是都破碎了1h了，沉淀中还是有好多目的蛋白。 |
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roomofxw
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那些既沉淀，还能表现活性的蛋白，叫什么呢？既然觉得文献不可信，没关系啊，我做点实验重复重复文献中提到的几种重组蛋白，再来汇报就是了。 肯定不止一篇文献啊，中英文相关报道都有的，我从引用中反查最早的一篇1989年报道酶的，当然我下不到全文，有兴趣查阅一下 The formation of biologically active beta-galactosidase inclusion bodies in Escherichia coli. Culture conditions affecting the formation of beta-galactosidase inclusion bodies in E. coli were examined. High temperature, early induction, high salt concentration and low aeration were all found to favour an increase of insoluble beta-galactosidase and the formation of visible inclusion bodies. The ratio of soluble to insoluble beta-galactosidase decreased during the course of cell growth. When assayed for beta-galactosidase activity, the inclusion bodies were enzymatically active with a specific activity of one third that of soluble beta-galactosidase. The activity remained associated with the inclusion bodies on washing with detergent and high ionic strength buffers. These results suggest that inclusion bodies can contain correctly folded protein. |
20楼2013-05-10 09:21:18
凌波丽
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2楼2013-05-07 21:55:22
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3楼2013-05-07 21:57:30
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【答案】应助回帖
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。同样期待你更详细的应助指导。 2013-05-08 09:12:08
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既然不清楚“固定化”酶本身与非酶的介质之间的链接到底是什么？那么可以先用破坏非共价键的把“固定化”酶从介质上解脱下来。比如用加入一些表面活性剂破坏“固定化”酶本身与非酶的介质之间的疏水相互作用，然后离心试试看。比如可以用低浓度的去污剂(浓度不大于2%的Triton X-100或浓度不大于0.5%SDS)洗涤样品（上样洗脱时）；增加洗脱液的盐浓度（氯化钠溶液低于2mol/L）；上样液里加入30%-50%的甘油，已减弱疏水相互作用，然后过层析住加以分离；或者用硫酸铵沉淀蛋白质-----分离蛋白质与生物大分子，而后除去硫酸铵再用用层析；如果酶石墨蛋白质则可用丙酮分级分离；另外疏水层析和离子交换树脂也可以用上；实在分离不开就用SDS-PAGE电泳分离，然后回收凝胶中 的蛋白质再进行复性。 |
4楼2013-05-07 22:09:57