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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白破碎后，上清的活性很低
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hraikeyan

金虫 (小有名气)

[求助] 蛋白破碎后，上清的活性很低

各位好心人，我最近在做蛋白表达。全细胞的酶活很高，用超声破碎后，破碎后上清活性很低，但沉淀的活性很高。蛋白电泳结果也是一样的，上清的条带很暗，沉淀很粗。我想应该是破碎不完全吧。我的破碎条件是这样的：破碎1s，暂停2s。总共这样循环破1h，功率45%。
各位做蛋白表达的同志们，能否给我些建议，我想我这应该不是形成包涵体吧，但是都破碎了1h了，沉淀中还是有好多目的蛋白。
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nothing isimpossible
1楼 2013-05-07 21:25:02
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roomofxw

木虫 (正式写手)
引用回帖:
18楼: Originally posted by 凌波丽 at 2013-05-09 11:31:55
蛋白质的晶体一般是有生物活性的，因为蛋白质的晶体含有相当质量比例的水，完全失去水蛋白质晶体一般会变为粉末，但是没有说这是包涵体。如果非要说包涵体不是那种原核基因表达产生的异常蛋白质折叠引起的固体的没有 ...

那些既沉淀，还能表现活性的蛋白，叫什么呢？既然觉得文献不可信，没关系啊，我做点实验重复重复文献中提到的几种重组蛋白，再来汇报就是了。
肯定不止一篇文献啊，中英文相关报道都有的，我从引用中反查最早的一篇1989年报道酶的，当然我下不到全文，有兴趣查阅一下
The formation of biologically active beta-galactosidase inclusion bodies in Escherichia coli.
Culture conditions affecting the formation of beta-galactosidase inclusion bodies in E. coli were examined. High temperature, early induction, high salt concentration and low aeration were all found to favour an increase of insoluble beta-galactosidase and the formation of visible inclusion bodies. The ratio of soluble to insoluble beta-galactosidase decreased during the course of cell growth. When assayed for beta-galactosidase activity, the inclusion bodies were enzymatically active with a specific activity of one third that of soluble beta-galactosidase. The activity remained associated with the inclusion bodies on washing with detergent and high ionic strength buffers. These results suggest that inclusion bodies can contain correctly folded protein.
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20楼2013-05-10 09:21:18
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。同样期待你更详细的应助指导。 2013-05-08 09:11:58
"蛋白电泳结果也是一样的，上清的条带很暗，沉淀很粗。"应该是形成了包涵体。但沉淀的活性很高，说明沉淀里有很多目的蛋白质不是包涵体，因为包涵体是变性的聚集体，一般为固体形态，没有生物活性。
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2楼2013-05-07 21:55:22
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

我想可能是酶与某些其他成分形成了共聚物，但是没有聚集成为固体状态，或者说类似于固定化酶的形态，所以目的酶还是有生物活性。
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3楼2013-05-07 21:57:30
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。同样期待你更详细的应助指导。 2013-05-08 09:12:08
既然不清楚“固定化”酶本身与非酶的介质之间的链接到底是什么？那么可以先用破坏非共价键的把“固定化”酶从介质上解脱下来。比如用加入一些表面活性剂破坏“固定化”酶本身与非酶的介质之间的疏水相互作用，然后离心试试看。比如可以用低浓度的去污剂(浓度不大于2%的Triton X-100或浓度不大于0.5%SDS)洗涤样品（上样洗脱时）；增加洗脱液的盐浓度（氯化钠溶液低于2mol/L）；上样液里加入30%-50%的甘油，已减弱疏水相互作用，然后过层析住加以分离；或者用硫酸铵沉淀蛋白质-----分离蛋白质与生物大分子，而后除去硫酸铵再用用层析；如果酶石墨蛋白质则可用丙酮分级分离；另外疏水层析和离子交换树脂也可以用上；实在分离不开就用SDS-PAGE电泳分离，然后回收凝胶中 的蛋白质再进行复性。

　　
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4楼2013-05-07 22:09:57
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