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蛋白破碎后，上清的活性很低
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各位好心人，我最近在做蛋白表达。全细胞的酶活很高，用超声破碎后，破碎后上清活性很低，但沉淀的活性很高。蛋白电泳结果也是一样的，上清的条带很暗，沉淀很粗。我想应该是破碎不完全吧。我的破碎条件是这样的：破碎1s，暂停2s。总共这样循环破1h，功率45%。 各位做蛋白表达的同志们，能否给我些建议，我想我这应该不是形成包涵体吧，但是都破碎了1h了，沉淀中还是有好多目的蛋白。 |
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【答案】应助回帖
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蛋白质的晶体一般是有生物活性的，因为蛋白质的晶体含有相当质量比例的水，完全失去水蛋白质晶体一般会变为粉末，但是没有说这是包涵体。如果非要说包涵体不是那种原核基因表达产生的异常蛋白质折叠引起的固体的没有生物活性的颗粒，那木这种原有概念又该用什么概念加以代替那！！？？仅仅凭借一篇无名的文献就说包涵体有活性，那没有活性的异常蛋白质折叠引起的固体的没有生物活性的颗粒又怎么算！！？？这算是概念严谨吗！！？？难道CNS没有大量支持“包涵体是那种原核基因表达产生的异常蛋白质折叠引起的固体的没有生物活性的颗粒”的概念吗？？？谁能证明那种原核基因表达产生的异常蛋白质折叠引起的固体在水相中是有生物活性的？？？相反的证据倒是有不少！ 一个科学的概念提出的时间与其存在的价值有必然联系吗？？现在又有谁能推翻达尔文进化论和爱因斯坦相对论？？有很多人试图这样做过。当然任何理论都有其使用范围，但是正确与错误不可能是因为时间变为一致。 |
18楼2013-05-09 11:31:55
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2楼2013-05-07 21:55:22
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3楼2013-05-07 21:57:30
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【答案】应助回帖
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myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。同样期待你更详细的应助指导。 2013-05-08 09:12:08
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。同样期待你更详细的应助指导。 2013-05-08 09:12:08
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既然不清楚“固定化”酶本身与非酶的介质之间的链接到底是什么？那么可以先用破坏非共价键的把“固定化”酶从介质上解脱下来。比如用加入一些表面活性剂破坏“固定化”酶本身与非酶的介质之间的疏水相互作用，然后离心试试看。比如可以用低浓度的去污剂(浓度不大于2%的Triton X-100或浓度不大于0.5%SDS)洗涤样品（上样洗脱时）；增加洗脱液的盐浓度（氯化钠溶液低于2mol/L）；上样液里加入30%-50%的甘油，已减弱疏水相互作用，然后过层析住加以分离；或者用硫酸铵沉淀蛋白质-----分离蛋白质与生物大分子，而后除去硫酸铵再用用层析；如果酶石墨蛋白质则可用丙酮分级分离；另外疏水层析和离子交换树脂也可以用上；实在分离不开就用SDS-PAGE电泳分离，然后回收凝胶中 的蛋白质再进行复性。 |
4楼2013-05-07 22:09:57