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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » SaII和BamHI双酶切切不开
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zhuqinjian

金虫 (小有名气)

[求助] SaII和BamHI双酶切切不开

我用T载体与目的片段连接后，导入JM109中，用菌落PCR也能P出目的片段，提取质粒后PCR也能P出来，电泳跑出来的片段也正确（环状片段跑出来有3条带），但是用SaII和BamHI双酶切就是切不出来，只有一条带。求大神指导啊？是不是只是单酶切了啊？为啥双酶切切不出来呢？
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1楼2013-05-02 08:44:56
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8601

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhuqinjian: 金币+6, ★★★很有帮助, 有可能是这个原因，现在还在试一次 2013-05-03 09:13:09
zhuqinjian(gyesang代发): 金币+2, 鼓励回帖应助！SalI确实不好用，不管是哪个公司的！ 2013-05-03 20:22:59
gyesang: 回帖置顶 2013-05-03 20:23:11
SalI 这个酶感觉活性不如其他酶。 可能你的DNA里面有些杂质，抑制了SalI的活性。我曾经遇到过这样的情况，做了几个miniprep, 用bamHI 和 XhoI 都能切开，用SalI 时有的能全部切开，有时只有很微弱的带子，有的压根切不开。如果你非要用SalI，建议你先做下乙醇沉淀 （记得要加糖原），这样DNA会比较干净，比较容易被切开。
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7楼2013-05-03 06:40:07
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stevenshi021

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhuqinjian: 金币+5, ★有帮助, 单酶切做了下，发现Sal I没有切开，哎不知道怎么回事 2013-05-02 11:01:09
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-02 12:01:23
分别做单切，确定是那个酶不能工作！此外，PCR的鉴定时候是否有加入阴性与阳性对照，我想担心你所看到的片段是都就是目的片段！希望对你有用！
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2楼2013-05-02 10:20:52
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dafeizizhu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhuqinjian: 金币+3, ★有帮助, 我是用捷瑞的试剂盒提的质粒，我觉得应该不是这个问题吧 2013-05-02 11:02:21
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-02 12:01:31
酶切之前，样品质粒要进行除酶，除盐，除乙醇等处理。一般就是酚氯仿抽提，技术要过关，不要在后面醇沉时留下太多的乙醇。上面说的单酶切验证酶是否失效是可行的，但是样品必须干净。内切酶很受离子和乙醇等物质影响的。
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3楼2013-05-02 10:50:02
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhuqinjian: 金币+5, ★有帮助, 的确是这样的，我考虑重新连T载体再做一下，然后再送去测序 2013-05-02 11:03:49
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-02 12:01:38
gyesang: 回帖置顶 2013-05-02 12:01:46
用载体上的引物对插入片段测序，最靠谱
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4楼2013-05-02 11:01:08
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