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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » SaII和BamHI双酶切切不开
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zhuqinjian

金虫 (小有名气)

[求助] SaII和BamHI双酶切切不开

我用T载体与目的片段连接后，导入JM109中，用菌落PCR也能P出目的片段，提取质粒后PCR也能P出来，电泳跑出来的片段也正确（环状片段跑出来有3条带），但是用SaII和BamHI双酶切就是切不出来，只有一条带。求大神指导啊？是不是只是单酶切了啊？为啥双酶切切不出来呢？
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1楼 2013-05-02 08:44:56
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dafeizizhu

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhuqinjian: 金币+3, ★有帮助, 我是用捷瑞的试剂盒提的质粒，我觉得应该不是这个问题吧 2013-05-02 11:02:21
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-02 12:01:31
酶切之前，样品质粒要进行除酶，除盐，除乙醇等处理。一般就是酚氯仿抽提，技术要过关，不要在后面醇沉时留下太多的乙醇。上面说的单酶切验证酶是否失效是可行的，但是样品必须干净。内切酶很受离子和乙醇等物质影响的。
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3楼2013-05-02 10:50:02
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stevenshi021

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhuqinjian: 金币+5, ★有帮助, 单酶切做了下，发现Sal I没有切开，哎不知道怎么回事 2013-05-02 11:01:09
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-02 12:01:23
分别做单切，确定是那个酶不能工作！此外，PCR的鉴定时候是否有加入阴性与阳性对照，我想担心你所看到的片段是都就是目的片段！希望对你有用！
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2楼2013-05-02 10:20:52
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gongeleven

铁杆木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhuqinjian: 金币+5, ★有帮助, 的确是这样的，我考虑重新连T载体再做一下，然后再送去测序 2013-05-02 11:03:49
gyesang: 金币+1, 鼓励回帖应助！ 2013-05-02 12:01:38
gyesang: 回帖置顶 2013-05-02 12:01:46
用载体上的引物对插入片段测序，最靠谱
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4楼2013-05-02 11:01:08
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gyesang

荣誉版主 (著名写手)

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhuqinjian: 金币+5, ★★★很有帮助, 恩，也有可能捷瑞引物合成的问题，再做一次看看，然后送去测序 2013-05-02 14:00:49
4楼说的对，你把T载体送去测序，看看这两个酶切位点的合成是否有误，有时候问题也有可能会出现在引物合成上，给酶切位点序列给合成突变掉了
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学术问题讨论咨询发邮件gyesang@163.com
5楼2013-05-02 12:02:56
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