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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 逆转录和PCR
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ckk1987

禁虫 (正式写手)
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分子生化实验经验积累

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1楼 2013-04-09 18:33:34
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
ckk1987(myprayer代发): 金币+2, 赠人玫瑰手有余香，鼓励应助，分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-10 08:46:56
ckk1987: 金币+1 2013-04-10 08:55:41
ckk1987: 金币+1 2013-04-10 12:22:06
你后面的PCR体系是25μl, 10×buffer怎么是5ul?
有没有做证对照（P内参基因）？此外，反转录时候的RNA需要定量，因为反应中RNA太多或者太少都会影响逆转录的效果。你说的估算，是在逆转录的时候加了大致多少μg的RNA呢？
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2楼2013-04-10 02:26:57
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ckk1987

禁虫 (正式写手)
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3楼2013-04-10 08:44:20
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ckk1987

禁虫 (正式写手)
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4楼2013-04-10 08:49:51
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guaiyaya

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
ckk1987: 金币+1 2013-04-10 12:21:55
合成CDNA没必要加这么多RNA，4微升差不多就够了，反应体系不是20吗，怎么又加DD水到25微升了呢？
建议用TBE跑胶，时间大约15到20分钟
还有，我之前也是出现这种情况，RNA提的不错就是转不出来，最后才发现原来转录的时候没有用无RNA酶的枪头盒离心管，总之，会有好多想不到的原因，建议楼主再重新理一下步骤。。。祝实验顺利
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5楼2013-04-10 10:55:01
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ckk1987

禁虫 (正式写手)
本帖内容被屏蔽
6楼2013-04-10 12:21:49
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
4楼: Originally posted by ckk1987 at 2013-04-10 08:49:51
做了内参基因，我知道需要定量，但实验室没有这个条件，差不多100ng吧！...

100ng总RNA不算多，一般逆转录可以做1μg。逆转录完成后稀释5-10倍，用1μl做PCR模板。
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7楼2013-04-10 14:34:01
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)
引用回帖:
3楼: Originally posted by ckk1987 at 2013-04-10 08:44:20
上面我的反应体系中是不是应该是50ul的总体积？那这些量应该怎样调整？...

引物、dNTP都没有注明浓度，不好说需要怎样调整。PCR反应根据聚合酶不同，一般都有建议的反应体系。
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8楼2013-04-10 14:42:48
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shuanyu0202

木虫 (小有名气)
个人认为你的反转录加的RNA过多，我们提组织的RNA一般是大米粒大小的组织，加40ul的水来溶，浓度都能有微克，反转录有时候都加不到1ul，总量都是使用1ug，如果你没有办法定量的话可以试着跑琼脂糖电泳粗略定量。加不同体积的RNA来跑电泳，然后跟Mark的亮度来比较。
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9楼2013-04-10 16:21:15
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shui_hanliu

金虫 (正式写手)
有没有做内参，比如说GAPDH，如果内参可以出来，说明cDNA没有问题，你得改善PCR条件
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10楼2013-04-10 17:07:43
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