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porphybaby

金虫 (正式写手)

[求助] 如果从来没做过RT-PCR，要上手而且把结果做得好大概要做多久啊？

我只是做了Western blot，已经做完了，做出效果了。

不过还想补一下RT-PCR，想有个互相印证。
可是我师姐她们总是说RT-PCR比WB难做得多，不太想让我再折腾。
我想问，如果像我这种完全没经验的，只懂养细胞和做WB的，要把RT-PCR做好，需要多长时间啊？
我觉得药物作用浓度和作用时间啊那些我都不用摸了，跟WB完全一致就行了。应该会省了不少事儿吧？
其实就是提mRNA 然后逆转录 PCR那样。。
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1楼 2012-12-15 12:50:46
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
porphybaby: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-12-15 14:54:01
总体上说做RNA的确不如WB容易，方法也没有什么，关键是操作。能否把结果做得漂亮也因人而异。
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2楼2012-12-15 14:20:48
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zgb1982

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
porphybaby: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-12-15 14:56:07
一周就行了吧，刚开始严格按步骤来不是很难，如果你是做realtime的话，主要是引物设计好。我常作这个，对我来说没做过WB，觉得好高深啊
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3楼2012-12-15 14:21:58
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porphybaby

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by zgb1982 at 2012-12-15 14:21:58
一周就行了吧，刚开始严格按步骤来不是很难，如果你是做realtime的话，主要是引物设计好。我常作这个，对我来说没做过WB，觉得好高深啊

一周这么快？？

我是要做Realtime 的RT-PCR，不做跑电泳的那种。

引物设计的话，已经有文献报道过引物序列，那应该就不需要自己再另行设计了对吧？

我师姐总是吓唬我说 这个实验 很麻烦~~而且很容易失败。。不知是不是这样
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4楼2012-12-15 14:56:00
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★
porphybaby: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-12-16 23:10:39
引用回帖:
4楼: Originally posted by porphybaby at 2012-12-15 14:56:00
一周这么快？？

我是要做Realtime 的RT-PCR，不做跑电泳的那种。

引物设计的话，已经有文献报道过引物序列，那应该就不需要自己再另行设计了对吧？

我师姐总是吓唬我说 这个实验 很麻烦~~而且很容易失败。 ...

引物主要是考虑不形成稳定二级结构和二聚体，此外就是所有引物扩增片段的大小和引物的Tm。如果有引物序列并且也是做realtime的可以直接定引物。最关键是提好RNA样品，操作时候小心不要污染。
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5楼2012-12-16 00:56:28
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

顺便问一下你是做原核生物还是真话生物？
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6楼2012-12-16 00:58:20
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zgb1982

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
porphybaby: 金币+1 2012-12-16 23:10:29
常见的材料提RNA技术已经很成熟了，买来的试剂盒按步骤来一般问题不大，realtime的话你用的所有耗材和试剂都用进口的，多做几个重复，有些时候确实重复性不太好，可能是灵敏度太高吧
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7楼2012-12-16 16:03:59
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porphybaby

金虫 (正式写手)
我做真核生物啊，肿瘤细胞。

不过现在打算暂时不做了。想先把论文投出去，审稿人有疑问才补。
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8楼2012-12-16 23:12:05
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stewart3261

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by porphybaby at 2012-12-15 14:56:00
一周这么快？？

我是要做Realtime 的RT-PCR，不做跑电泳的那种。

引物设计的话，已经有文献报道过引物序列，那应该就不需要自己再另行设计了对吧？

我师姐总是吓唬我说 这个实验 很麻烦~~而且很容易失败。 ...

一周时间足够学习了。实时定量要比跑胶简单一些。引物设计是比较重要的，文献报道不见得就能合适。师姐的经验也是比较重要的。如果想得到比较满意的结果，花费的时间还是不少的！
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9楼2012-12-17 09:22:34
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porphybaby

金虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by stewart3261 at 2012-12-17 09:22:34
一周时间足够学习了。实时定量要比跑胶简单一些。引物设计是比较重要的，文献报道不见得就能合适。师姐的经验也是比较重要的。如果想得到比较满意的结果，花费的时间还是不少的！...

就是，我们学校另一个课题组他们有做过跟我所需要的完全一样的蛋白的RT-PCR，而且已经做得很成熟。引物就跟他们一样的。

只是我们是化学和药学的，而我师姐去生物那边做RT，他们的过程就会繁琐得多。尤其是，他们会有个用DNAase处理样品，以及RNA纯化柱处理。所以整个过程就多了很多步骤，折腾来折腾去的。

我不知道那种传统的Trizol提取，然后异丙醇沉淀，再乙醇吹干，DEPC水溶解，定量，cDNA，PCR。这样的，没有RNA纯化柱那些，会不会不好。
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10楼2012-12-17 14:43:45
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