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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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ckk1987

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cicelyzh

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【答案】应助回帖

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感谢参与,应助指数 +1
ckk1987(myprayer代发): 金币+2, 赠人玫瑰手有余香,鼓励应助,分子生物版块期待你的更多精彩。 2013-04-10 08:46:56
ckk1987: 金币+1 2013-04-10 08:55:41
ckk1987: 金币+1 2013-04-10 12:22:06
你后面的PCR体系是25μl, 10×buffer怎么是5ul?
有没有做证对照(P内参基因)?此外,反转录时候的RNA需要定量,因为反应中RNA太多或者太少都会影响逆转录的效果。你说的估算,是在逆转录的时候加了大致多少μg的RNA呢?
2楼2013-04-10 02:26:57
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ckk1987

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3楼2013-04-10 08:44:20
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ckk1987

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4楼2013-04-10 08:49:51
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guaiyaya

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感谢参与,应助指数 +1
ckk1987: 金币+1 2013-04-10 12:21:55
合成CDNA没必要加这么多RNA,4微升差不多就够了,反应体系不是20吗,怎么又加DD水到25微升了呢?
建议用TBE跑胶,时间大约15到20分钟
还有,我之前也是出现这种情况,RNA提的不错就是转不出来,最后才发现原来转录的时候没有用无RNA酶的枪头盒离心管,总之,会有好多想不到的原因,建议楼主再重新理一下步骤。。。祝实验顺利
5楼2013-04-10 10:55:01
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ckk1987

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6楼2013-04-10 12:21:49
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cicelyzh

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引用回帖:
4楼: Originally posted by ckk1987 at 2013-04-10 08:49:51
做了内参基因,我知道需要定量,但实验室没有这个条件,差不多100ng吧!...

100ng总RNA不算多,一般逆转录可以做1μg。逆转录完成后稀释5-10倍,用1μl做PCR模板。
7楼2013-04-10 14:34:01
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cicelyzh

实习版主

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引用回帖:
3楼: Originally posted by ckk1987 at 2013-04-10 08:44:20
上面我的反应体系中是不是应该是50ul的总体积?那这些量应该怎样调整?...

引物、dNTP都没有注明浓度,不好说需要怎样调整。PCR反应根据聚合酶不同,一般都有建议的反应体系。
8楼2013-04-10 14:42:48
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shuanyu0202

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个人认为你的反转录加的RNA过多,我们提组织的RNA一般是大米粒大小的组织,加40ul的水来溶,浓度都能有微克,反转录有时候都加不到1ul,总量都是使用1ug,如果你没有办法定量的话可以试着跑琼脂糖电泳粗略定量。加不同体积的RNA来跑电泳,然后跟Mark的亮度来比较。
9楼2013-04-10 16:21:15
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shui_hanliu

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有没有做内参,比如说GAPDH,如果内参可以出来,说明cDNA没有问题,你得改善PCR条件
10楼2013-04-10 17:07:43
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