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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大引物PCR所出现的问题，求助
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xuzhe2240

银虫 (初入文坛)

[求助] 大引物PCR所出现的问题，求助 已有1人参与

本人最近在做易错PCR，参考文献使用MEGAWHOP Cloning的方法，使用易错PCR产物（大约1200bp左右）作为引物，全质粒作为模版进行PCR。体系中使用了Takara的PrimeSTAR HS DNA Polymerase，总体积100微升，20微升5*PS Buffer,8微升dNTPs，4微升易错PCR回收片段，1微升全质粒模版，1微升酶，分装之后进行PCR。PCR条件为72℃-5min，98℃-3min，98℃-10s，60-65℃-10s，72℃-6min（30个循环），72℃-10min，4℃-保存。
现在出现以下问题：1.PCR后0.9%琼脂糖凝胶电泳检测，胶孔非常亮，但是应该不会有蛋白质和基因组污染的问题。2.PCR产生的条带偏大很多，图中所用的是DL10000的Marker，有一条明显的10000+条带。3.PCR产物经过DpnI消化后转化涂平板，没办法长，尝试过对PCR产物进行浓缩，但是效果不佳。
希望大家帮我分析一下问题出在哪儿，先谢谢大家了。

xz20130401.jpg
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1楼 2013-04-08 09:06:42
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tete1987

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

我现在也在做全质粒PCR构建文库，用的跟你相同的条件。今天刚做完第二步PCR，点了8ul，能够看见条带。
我觉得这种方法应该P不出来很亮的质粒条带；
质粒很大，电泳看大小不准确；
所以楼主可以多点写样品看一下，能看到一点条带就可以做转化；
具体结果要以转化出来为准。
今天晚上做转化，转化出来结果再告诉你。
赞一下 回复此楼
嘿嘿，just for you~
2楼2013-12-20 16:25:04
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15222569263

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by tete1987 at 2013-12-20 16:25:04
我现在也在做全质粒PCR构建文库，用的跟你相同的条件。今天刚做完第二步PCR，点了8ul，能够看见条带。
我觉得这种方法应该P不出来很亮的质粒条带；
质粒很大，电泳看大小不准确；
所以楼主可以多点写样品看一 ...

问一下做的结果如何？我现在也在做易错PCR，但是转化均为假阳性。。。
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3楼2016-03-17 21:34:57
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