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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 甲醇诱导毕赤酵母72h，SDS-PAGE电泳未看到任何条带
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razi

新虫 (小有名气)

[求助] 甲醇诱导毕赤酵母72h，SDS-PAGE电泳未看到任何条带

实验周期太长了，快20天了，功亏一篑，伤不起啊
过程如下：
1、线性化重组质粒
2、制备感受态GS115
3、转化
4、MD平板筛选HIS+重组子
5、G418筛选多拷贝重组子
6、甲醇诱导表达
7、72h后取样离心，转移上清，保存
8、上清与5×loading buffer混合，煮沸3min，SDS-PAGE电泳
结果：
1、电泳鉴定
5、2mg/ml几乎全部长出
4mg/ml长出1/3
6mg/ml长出1/10
8、marker出现条带，而样品没看到任何条带
请各位帮忙分析可能原因，谢谢！

[ Last edited by razi on 2013-3-23 at 20:51 ]
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1楼 2013-03-23 20:47:45
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susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
myprayer: 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-31 09:52:59
思路没问题，关键是你上清还没浓缩了。是浓度太低，不一定是没有表达。看你蛋白大小，买相应的超滤管，将上清浓缩后再跑PAGE。
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Thank-you，so-blue.
2楼2013-03-25 16:16:19
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lifuzhu3838

金虫 (小有名气)
★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-31 09:53:18
交流一下，我最近也在用G418筛选多拷贝，这次只筛到了1mg/ml，但是都是长了，就拿了一个空白的GS115菌往板子上涂了一点，结果这菌也长起来了！！我用的生工的G418，不知道是不是坏了，还是我的手法不对啊
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活到老学到老
3楼2013-08-08 16:39:16
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razi

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by lifuzhu3838 at 2013-08-08 16:39:16
交流一下，我最近也在用G418筛选多拷贝，这次只筛到了1mg/ml，但是都是长了，就拿了一个空白的GS115菌往板子上涂了一点，结果这菌也长起来了！！我用的生工的G418，不知道是不是坏了，还是我的手法不对啊

菌不是空菌吧
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4楼2013-08-30 20:02:14
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lifuzhu3838

金虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by razi at 2013-08-30 20:02:14
菌不是空菌吧...

线性化电转的

[ 发自小木虫客户端 ]
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活到老学到老
5楼2013-08-30 20:25:23
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xiaopeiliang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by lifuzhu3838 at 2013-08-08 16:39:16
交流一下，我最近也在用G418筛选多拷贝，这次只筛到了1mg/ml，但是都是长了，就拿了一个空白的GS115菌往板子上涂了一点，结果这菌也长起来了！！我用的生工的G418，不知道是不是坏了，还是我的手法不对啊

G418筛选的时候受细胞浓度的影响较大，注意涂板时候细胞的浓度，好好看看毕赤酵母表达手册
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6楼2013-08-30 22:02:46
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xiaopeiliang

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰，手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-31 09:50:12
思路是对的，但是说的太笼统了，看不出哪里有问题，只能2楼说的你先浓缩下上清看一下，此外建议下，虽然是用的分泌质粒，但是还是把菌体破碎下看看蛋白是不是在胞内没有分泌出来，加油哦
诱导有时候没必要这么长时间，可以分段取样看下，
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7楼2013-08-30 22:08:15
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qiuqiushine

新虫 (初入文坛)
你好，转化后在MD上长出的菌落，不用做菌落PCR验证吗？请问你是怎么验证你的目的基因整合上去了呢？我转后后MD上的菌落进行PCR验证，总是没有目的条带的出现，不知道是不是我菌落PCR做的不对，我是直接用牙签占些菌落到加好的PCR成分的PCR管，然后进行PCR，很纠结，请赐教，不胜感激
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8楼2013-12-16 16:18:13
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浅浅的爱4125

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
8楼: Originally posted by qiuqiushine at 2013-12-16 16:18:13
你好，转化后在MD上长出的菌落，不用做菌落PCR验证吗？请问你是怎么验证你的目的基因整合上去了呢？我转后后MD上的菌落进行PCR验证，总是没有目的条带的出现，不知道是不是我菌落PCR做的不对，我是直接用牙签占些菌 ...

菌落PCR做大肠很方便，但是酵母就有点困难了，毕竟酵母的细胞壁比大肠的坚固。我一开始也是挑取MD板上的菌直接菌落PCR，但是结果不太理想，然后就换了方法验证：提取酵母基因组DNA，然后以基因组DNA为模板再去扩PCR，结果很好。
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9楼2016-01-12 11:19:11
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