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北京石油化工学院2026年研究生招生接收调剂公告
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razi

新虫 (小有名气)

[求助] 甲醇诱导毕赤酵母72h,SDS-PAGE电泳未看到任何条带

实验周期太长了,快20天了,功亏一篑,伤不起啊
过程如下:
1、线性化重组质粒
2、制备感受态GS115
3、转化
4、MD平板筛选HIS+重组子
5、G418筛选多拷贝重组子
6、甲醇诱导表达
7、72h后取样离心,转移上清,保存
8、上清与5×loading buffer混合,煮沸3min,SDS-PAGE电泳
结果:
1、电泳鉴定
5、2mg/ml几乎全部长出
4mg/ml长出1/3
6mg/ml长出1/10
8、marker出现条带,而样品没看到任何条带
请各位帮忙分析可能原因,谢谢!

[ Last edited by razi on 2013-3-23 at 20:51 ]
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浅浅的爱4125

新虫 (初入文坛)

引用回帖:
8楼: Originally posted by qiuqiushine at 2013-12-16 16:18:13
你好,转化后在MD上长出的菌落,不用做菌落PCR验证吗?请问你是怎么验证你的目的基因整合上去了呢?我转后后MD上的菌落进行PCR验证,总是没有目的条带的出现,不知道是不是我菌落PCR做的不对,我是直接用牙签占些菌 ...

菌落PCR做大肠很方便,但是酵母就有点困难了,毕竟酵母的细胞壁比大肠的坚固。我一开始也是挑取MD板上的菌直接菌落PCR,但是结果不太理想,然后就换了方法验证:提取酵母基因组DNA,然后以基因组DNA为模板再去扩PCR,结果很好。
9楼2016-01-12 11:19:11
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查看全部 9 个回答

susizheng

木虫 (著名写手)

我們是糖 甜到憂傷

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
myprayer: 赠人玫瑰,手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-31 09:52:59
思路没问题,关键是你上清还没浓缩了。是浓度太低,不一定是没有表达。看你蛋白大小,买相应的超滤管,将上清浓缩后再跑PAGE。
Thank-you,so-blue.
2楼2013-03-25 16:16:19
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lifuzhu3838

金虫 (小有名气)


myprayer: 金币+1, 赠人玫瑰,手有余香。分子生物期待你更多精彩 2013-08-31 09:53:18
交流一下,我最近也在用G418筛选多拷贝,这次只筛到了1mg/ml,但是都是长了,就拿了一个空白的GS115菌往板子上涂了一点,结果这菌也长起来了!!我用的生工的G418,不知道是不是坏了,还是我的手法不对啊
活到老学到老
3楼2013-08-08 16:39:16
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razi

新虫 (小有名气)

引用回帖:
3楼: Originally posted by lifuzhu3838 at 2013-08-08 16:39:16
交流一下,我最近也在用G418筛选多拷贝,这次只筛到了1mg/ml,但是都是长了,就拿了一个空白的GS115菌往板子上涂了一点,结果这菌也长起来了!!我用的生工的G418,不知道是不是坏了,还是我的手法不对啊

菌不是空菌吧
4楼2013-08-30 20:02:14
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