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[求助]
sds-page 凝胶电泳求助 只有marker条带是清晰的，但宽窄不一 已有9人参与
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浓缩胶5%，电压80V,分离胶10% 电压160V，跑胶结果很不理想，marker 条带越跑越窄，样品条带越跑越宽，且不清晰，到底是什么原因，还请大家指点迷津。 sds-page.jpg |
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 蛋白质生物学实验经验 |
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tujuo
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11楼2014-05-15 13:53:24
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【答案】应助回帖
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SDS电泳带变宽的原因和改进措施(2013-10-7) 在下写的，参考一下了 1.原因一：上样量过多，应该减少上样量。对策：加样体积根据样品浓度和凝胶厚度灵活掌握。一般上样体积为10-15μL（即2-10μg蛋白质）。如果样品很稀上样量可以达到100μL。 2.原因二：样品溶解不完全。 对策： （1）样品应该充分溶解：保持各种蛋白质样品和Marker在上样前能够充分溶解，上样前最好离心一下，实在溶解不掉的颗粒就去掉。 (2)可以根据分子量标准的蛋白质试剂盒的要求加入样品溶解液；如果是自行配置标准和未知样品，按照0.5-1.0mg/L样品溶解液。溶解后，将其转移至Eppendorf管，盖上盖子（可以在盖子处加上卡子）后在110度沸水中水浴加热3分钟（可以在薄泡沫塑料板上钻出几个与Eppendorf管直径形同的圆洞，Eppendorf管放下去直到盖子边缘约束不能再往下为止，把薄泡沫塑料板的暴露出Eppendorf管的管体大部分的那一面放入沸水浴锅中，薄泡沫塑料板自然飘在沸水表面，便于取用和加热，也可避免沸水溅起。可以一批对于多个Eppendorf管进行不同时间的沸水浴。不要把Eppendorf管扔进沸水浴锅中，盖子可能会被冲开），而后在室温下冷却待用。如果较长时间不用，则将样品放入零下20度冰箱中储存，需用时在取出后使用前在110度沸水中加热3分钟室温冷却后再上样，以去掉样品蛋白质中的亚稳态聚合体。 （3）改变样品缓冲溶液使得样品能够充分溶解，SDS 用量要充分。 原因三：SDS电泳带与邻近蛋白质电泳相连。除了上样量过多和样品溶解不完全外，凝胶的加样孔泄露会使得电泳带变宽。加样孔泄露往往由于凝胶与玻璃板之间产生裂纹引起。对策：此时只能重新制备凝胶，梳子拔起时要小心等凝胶凝聚完毕，速度不宜过快，拔起的方向要垂直于凝胶表面；要避免凝胶两侧的玻璃板与凝胶之间产生裂纹，在凝胶制备过程中不要挤压凝胶两侧的玻璃板。 |
16楼2014-07-07 23:46:17
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