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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白电泳/WB » sds-page 凝胶电泳求助 只有marker条带是清晰的，但宽窄不一
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tujuo

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
valleybeau: 金币+3, ★有帮助, 每孔上样就没有条带宽窄不一的情况 其实是上样浓度太低导致条带模糊 2014-06-11 21:08:25
valleybeau: 金币+2 2014-10-16 11:16:20
你可以在空白孔和markrr孔补适量的上样缓冲液。而且你的蛋白提的也不太好，看起来条带分不开。

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如果能让自己不在等待中苍老，又何尝不想活得洒脱。。。
11楼2014-05-15 13:53:24
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valleybeau

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by cherishhp at 2014-05-15 13:48:12
样品太浓了，把marker挤着了

这个问题已经解决了，解决的方法是每个孔的上样体积一样。
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12楼2014-05-15 13:56:27
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valleybeau

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
11楼: Originally posted by tujuo at 2014-05-15 13:53:24
你可以在空白孔和markrr孔补适量的上样缓冲液。而且你的蛋白提的也不太好，看起来条带分不开。

每个孔加了同样的体积，确实没有出现上下宽窄不一的情况。条带还是不清晰，又提了一遍，看看结果再说吧。
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13楼2014-05-15 13:59:41
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fifiss

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

样品太浓了，上样少点
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14楼2014-05-15 20:29:51
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pengchenping

铁虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

引用回帖:
8楼: Originally posted by valleybeau at 2014-05-15 13:25:20
我用80V的电压跑了浓缩胶与分离胶，分离胶改为7.5%,发现条带还没有完全分离开来的时候就跑到底了，比如marker有7条带，只跑出来5条，样品蛋白条带也明显下移，是不是由于分离胶电压太小的原因？...

胶浓度也太低了吧

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15楼2014-07-07 20:49:45
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凌波丽

专家顾问 (知名作家)

【答案】应助回帖

SDS电泳带变宽的原因和改进措施(2013-10-7)

在下写的，参考一下了

1.原因一：上样量过多，应该减少上样量。对策：加样体积根据样品浓度和凝胶厚度灵活掌握。一般上样体积为10-15μL（即2-10μg蛋白质）。如果样品很稀上样量可以达到100μL。
2.原因二：样品溶解不完全。
对策：
（1）样品应该充分溶解：保持各种蛋白质样品和Marker在上样前能够充分溶解，上样前最好离心一下，实在溶解不掉的颗粒就去掉。
(2)可以根据分子量标准的蛋白质试剂盒的要求加入样品溶解液；如果是自行配置标准和未知样品，按照0.5-1.0mg/L样品溶解液。溶解后，将其转移至Eppendorf管，盖上盖子（可以在盖子处加上卡子）后在110度沸水中水浴加热3分钟（可以在薄泡沫塑料板上钻出几个与Eppendorf管直径形同的圆洞，Eppendorf管放下去直到盖子边缘约束不能再往下为止，把薄泡沫塑料板的暴露出Eppendorf管的管体大部分的那一面放入沸水浴锅中，薄泡沫塑料板自然飘在沸水表面，便于取用和加热，也可避免沸水溅起。可以一批对于多个Eppendorf管进行不同时间的沸水浴。不要把Eppendorf管扔进沸水浴锅中，盖子可能会被冲开），而后在室温下冷却待用。如果较长时间不用，则将样品放入零下20度冰箱中储存，需用时在取出后使用前在110度沸水中加热3分钟室温冷却后再上样，以去掉样品蛋白质中的亚稳态聚合体。
（3）改变样品缓冲溶液使得样品能够充分溶解，SDS 用量要充分。
原因三：SDS电泳带与邻近蛋白质电泳相连。除了上样量过多和样品溶解不完全外，凝胶的加样孔泄露会使得电泳带变宽。加样孔泄露往往由于凝胶与玻璃板之间产生裂纹引起。对策：此时只能重新制备凝胶，梳子拔起时要小心等凝胶凝聚完毕，速度不宜过快，拔起的方向要垂直于凝胶表面；要避免凝胶两侧的玻璃板与凝胶之间产生裂纹，在凝胶制备过程中不要挤压凝胶两侧的玻璃板。
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16楼2014-07-07 23:46:17
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冷月絮清风

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

分离胶跑胶的电压太大，120V最多，不然电渗力越大，条带就会模糊。Marker 越跑越窄是正常的，我们平时也是这样的，至于为什么越来越窄，猜测是越往下跑，蛋白总量越少，蛋白质之间本身的静电吸引使其聚集在中间。
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不偷懒，不拖拉
17楼2014-08-11 23:07:42
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shizhaomei

新虫 (初入文坛)
marker很好，样品不行，估计是蛋白降解了，或者是loading有问题，我也跑过这样的，换个新的loading就可以了
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18楼2014-11-05 16:39:55
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静待一片天yu

新虫 (初入文坛)
比如marker有7条带，只跑出来5条，样品蛋白条带也明显下移，是不是由于分离胶电压太小的原因？
是因为跑胶时间长了，小分子maker跑出去了。
你的蛋白浓度太大了，可以稀释下，或者上样量减少试试！
祝好运！
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19楼2014-12-08 14:33:13
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