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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 有关蛋白诱导的问题
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zhjzhou

木虫 (著名写手)

[求助] 有关蛋白诱导的问题

各位大侠，有做原核表达，诱导蛋白的吗？我用的载体是PET28a,把自己的目的基因克隆到载体中，测序都正确的，然后做诱导，0.1mM的IPTG诱导28度12h，前面是mark，后面第1通道是对照，没有诱导的，后面依次是2：诱导后；3-5：纯化时，接到的蛋白；6-7：纯化后的蛋白；8：透析后的蛋白；9：flow through。
纯化后的蛋白不是我的目的蛋白啊，我的目的蛋白只有40KD左右，现在这个要100多KD啊，不知道怎么回事？有没有知道的啊？帮忙看看，谢谢！

1.jpg[ Last edited by zhjzhou on 2013-3-21 at 14:17 ]
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1楼 2013-03-21 10:58:35
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无为书生

铁虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhjzhou: 金币+2, ★有帮助, 是啊，纯化的这个不是我的目的蛋白啊，我的目的蛋白没有那么大，不知道这条是什么 2013-03-21 19:17:47
貌似你的目的蛋白就没有表达，纯化的不是目的蛋白！
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2楼2013-03-21 16:26:01
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qianjinyu

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhjzhou: 金币+3, ★有帮助, 上样缓冲液里有巯基乙醇的，那最粗的诱导表达的不是我的目的蛋白啊，比我的目的蛋白大很多，我的目的蛋白只有40多，这个要100多呢，是不是形成的二聚体啊？ 2013-03-21 19:19:38
对一下读码框，看一下东西有没有弄错！如果都没错的话，检查一下上样液里面有没有巯基乙醇，最粗的那个应该是诱导表达条带
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3楼2013-03-21 19:14:02
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zhjzhou

木虫 (著名写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 无为书生 at 2013-03-21 16:26:01
貌似你的目的蛋白就没有表达，纯化的不是目的蛋白！

是啊，我的目的蛋白没有那么大，纯化的这个不知道是什么
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4楼2013-03-21 19:16:53
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zhjzhou

木虫 (著名写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by qianjinyu at 2013-03-21 19:14:02
对一下读码框，看一下东西有没有弄错！如果都没错的话，检查一下上样液里面有没有巯基乙醇，最粗的那个应该是诱导表达条带

上样缓冲液里有巯基乙醇的，那最粗的诱导表达的不是我的目的蛋白啊，比我的目的蛋白大很多，我的目的蛋白只有40多，这个要100多呢，是不是形成的二聚体啊？
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5楼2013-03-21 19:20:13
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wxl.1989822

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
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zhjzhou: 金币+3, ★有帮助, 谢谢！ 2013-03-21 22:29:59
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-03-23 22:16:52
虽然不知道你那个100多KD的是什么 但既然你说你的目的蛋白是40多KD 那你看你个孔道在44.3KD上面一点是不是有一条带啊  不是很明显 建议你IPTG浓度加大些 我最近也在做这个载体的纯化 终浓度用的是1mM
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6楼2013-03-21 20:02:40
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zhjzhou

木虫 (著名写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by wxl.1989822 at 2013-03-21 20:02:40
虽然不知道你那个100多KD的是什么 但既然你说你的目的蛋白是40多KD 那你看你个孔道在44.3KD上面一点是不是有一条带啊  不是很明显 建议你IPTG浓度加大些 我最近也在做这个载体的纯化 终浓度用的是1mM

我在想是不是我载体构建的不好啊，我现在在着手重新构建载体呢，要不再拿原来的菌按你说的重新诱导下？哎！实验啊
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7楼2013-03-21 22:30:58
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yinxiang_1

铜虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
zhjzhou: 金币+3, ★有帮助, 好的，谢谢！用纯化的蛋白做WB验证，可以试试，多谢！ 2013-03-23 11:14:33
做一个WB验证一下吧
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8楼2013-03-23 09:20:23
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zhjzhou

木虫 (著名写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by yinxiang_1 at 2013-03-23 09:20:23
做一个WB验证一下吧

好的，谢谢！用纯化的蛋白做WB验证，可以试试，多谢！
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9楼2013-03-23 11:15:01
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