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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » Western Blot结果 条带中间 不见了，请教高手！
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格子和潇潇

铜虫 (小有名气)

[求助] Western Blot结果 条带中间 不见了，请教高手！

第一次A样本，用B抗体曝光如下图：


第二次B样本，用同样的B抗体曝光出现了2条带，好像是中空的，两次的二抗浓度都是一样的，都是1:5000，可能是有些高，但是为啥第一次曝光就没事呢？


请教各位高手
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1楼2013-02-01 22:05:20
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

western这种半定量的实验需要在信号为饱和时比较。暴光过久导致部分信号饱和，比出来的结果也不好说明什么问题。
一种蛋白可能会有各种修饰，电泳时跑出不同条带也是正常的。单克隆抗体是一个抗原决定簇产生出来的抗体，总体上说比多克隆抗体的特异性会好一些。但是单克隆抗体也是有可能识别不同蛋白的。所以，不要以为单抗出来就一定是一条带。
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7楼2013-02-03 09:28:29
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 谢谢分析，欢迎交流 2013-02-03 09:32:08
问题可能有两种情况：
一：本身应该是一条带，由于电泳、转膜或者暴光胶片等原因，出现两条带。
二：抗体识别分子量接近的两条带，第一次由于抗体过强或者是电泳的原因，两条带没有分开。
我感觉第二种情况的可能性更大一些。
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2楼2013-02-02 12:12:22
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格子和潇潇

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-02-02 12:12:22
问题可能有两种情况：
一：本身应该是一条带，由于电泳、转膜或者暴光胶片等原因，出现两条带。
二：抗体识别分子量接近的两条带，第一次由于抗体过强或者是电泳的原因，两条带没有分开。
我感觉第二种情况的可能 ...

一抗为单克隆抗体，本身应该为一条带；
电泳、转膜都没问题，其他一起的内参背景较浓，很可能是二抗浓度大或者没洗好的原因；
曝光时间短或者长都是这个情况；
马上要回家了，也来不及验证了
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3楼2013-02-02 12:53:17
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ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
wizardfan: 金币+1, 谢谢参与 2013-02-03 09:33:55
第一次的曝光时间太长了
曝光要在看的出各泳道差异的情况下尽量浅一些
第二次的没问题
可能是抗体特异性/蛋白异构体/降解/修饰 各种原因
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4楼2013-02-02 20:31:30
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