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格子和潇潇

铜虫 (小有名气)

[求助] Western Blot结果 条带中间 不见了,请教高手!

第一次A样本,用B抗体曝光如下图:


第二次B样本,用同样的B抗体曝光出现了2条带,好像是中空的,两次的二抗浓度都是一样的,都是1:5000,可能是有些高,但是为啥第一次曝光就没事呢?


请教各位高手
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ccharlien

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
wizardfan: 金币+1, 谢谢参与 2013-02-03 09:33:55
第一次的曝光时间太长了
曝光要在看的出各泳道差异的情况下尽量浅一些
第二次的没问题
可能是抗体特异性/蛋白异构体/降解/修饰 各种原因
4楼2013-02-02 20:31:30
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

western这种半定量的实验需要在信号为饱和时比较。暴光过久导致部分信号饱和,比出来的结果也不好说明什么问题。
一种蛋白可能会有各种修饰,电泳时跑出不同条带也是正常的。单克隆抗体是一个抗原决定簇产生出来的抗体,总体上说比多克隆抗体的特异性会好一些。但是单克隆抗体也是有可能识别不同蛋白的。所以,不要以为单抗出来就一定是一条带。
7楼2013-02-03 09:28:29
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普通回帖

cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与,应助指数 +1
wizardfan: 金币+2, 谢谢分析,欢迎交流 2013-02-03 09:32:08
问题可能有两种情况:
一:本身应该是一条带,由于电泳、转膜或者暴光胶片等原因,出现两条带。
二:抗体识别分子量接近的两条带,第一次由于抗体过强或者是电泳的原因,两条带没有分开。
我感觉第二种情况的可能性更大一些。
2楼2013-02-02 12:12:22
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格子和潇潇

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by cicelyzh at 2013-02-02 12:12:22
问题可能有两种情况:
一:本身应该是一条带,由于电泳、转膜或者暴光胶片等原因,出现两条带。
二:抗体识别分子量接近的两条带,第一次由于抗体过强或者是电泳的原因,两条带没有分开。
我感觉第二种情况的可能 ...

一抗为单克隆抗体,本身应该为一条带;
电泳、转膜都没问题,其他一起的内参背景较浓,很可能是二抗浓度大或者没洗好的原因;
曝光时间短或者长都是这个情况;
马上要回家了,也来不及验证了
3楼2013-02-02 12:53:17
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格子和潇潇

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
4楼: Originally posted by ccharlien at 2013-02-02 20:31:30
第一次的曝光时间太长了
曝光要在看的出各泳道差异的情况下尽量浅一些
第二次的没问题
可能是抗体特异性/蛋白异构体/降解/修饰 各种原因

如果曝光太浅,虽然也有差异,毕竟不好看;
抗体单克隆,“各种原因”实在难以想象,不知有没有同学有过类似情况
5楼2013-02-02 23:05:58
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ccharlien

木虫 (正式写手)


wizardfan: 金币+1, calm down ;) 2013-02-03 09:34:55
引用回帖:
5楼: Originally posted by 格子和潇潇 at 2013-02-02 23:05:58
如果曝光太浅,虽然也有差异,毕竟不好看;
抗体单克隆,“各种原因”实在难以想象,不知有没有同学有过类似情况...

不复杂的问题,告诉你这些可能的原因你不当回事我也没办法了
单抗和是不是一条带没有多大关系,你可以多了解一些单抗的相关知识
6楼2013-02-03 04:28:33
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beescity

至尊木虫 (著名写手)

不是高手,学习WB时候也遇到过这样。
我觉得可能还与你检测的蛋白类型有关,是不是存在蛋白复合物?
8楼2013-02-04 09:28:36
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xiaoqi5992

银虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
我看你说两次蛋白样品不一样,你是不是可以尝试再用A样品做一次呢。
我感觉有可能是你的蛋白存在一些修饰,使它分子量产生了变化吧?只是可能啊
9楼2013-02-04 15:18:22
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烟大考研

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

这个问题我遇到过,呵呵,楼上说的很对,不同的蛋白修饰,不同的细胞分泌出来的蛋白序列一样但糖基修饰可能不一样
心信其可行,则移山填海之难,终有成功之日;心信其不可行,则反掌折枝之易,亦无收效之期
10楼2013-04-02 23:15:50
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