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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 提不出质粒的问题
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deepocean123

新虫 (初入文坛)

[求助] 提不出质粒的问题

本人菌落PCR成功的筛出了菌，将阳性菌挑出来摇菌也能摇起来，但是提不出质粒来或者浓度特别低，这是为什么呢？我换了不同的样，提了好几次了，就是不行。我用的是克隆载体--pEASY。
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1楼2013-01-28 08:23:15
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weebug

版主 (著名写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
看在LB里长你的菌株，扩增质粒量。或加入抗生素。当没筛选环境时，菌株通常会把质粒排除。
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天蓝蓝兮日头晒
2楼2013-01-28 15:04:14
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deepocean123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by weebug at 2013-01-28 15:04:14
看在LB里长你的菌株，扩增质粒量。或加入抗生素。当没筛选环境时，菌株通常会把质粒排除。

摇菌的时候是用的LB氨苄抗性的液体培养基，挑出来之前的菌落是长在含有氨苄抗性的LB固体培养基的。我这个应该是算筛选环境吧~？
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3楼2013-01-28 23:01:31
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putine

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
PCR用的引物是载体的还是载体加片段的？会不会是假阳性。你说提出的质粒浓度特别低，可以做测序或者酶切吗？
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4楼2013-01-29 01:03:43
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weebug

版主 (著名写手)
或是那质粒在每一菌体里只有一两份而已。
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天蓝蓝兮日头晒
5楼2013-01-29 09:13:24
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deepocean123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by putine at 2013-01-29 01:03:43
PCR用的引物是载体的还是载体加片段的？会不会是假阳性。你说提出的质粒浓度特别低，可以做测序或者酶切吗？

载体引物和片段引物都试了，都有目的条带；我做了阴性对照，阴性对照上没有带。测序倒是没做，因为浓度低酶切之后带很弱，隐约觉得能切开~
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6楼2013-01-30 09:32:36
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deepocean123

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by weebug at 2013-01-29 09:13:24
或是那质粒在每一菌体里只有一两份而已。

如果是这个问题那怎么解决？
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7楼2013-01-30 09:33:01
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zhang881007

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

找个高copy的质粒，重新连接一下。有时表达菌株质粒与工程质粒目的不同，质粒的产生量有许多差异。
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shine
8楼2013-01-31 11:10:03
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kagamiya

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

我第一反应就是质粒提取试剂盒的问题
如果你是要提质粒送测序的话，劝你别费劲了，直接送菌液，然后让测序公司把提好的质粒返回给你，你再做转化、表达。
如果能这样解决问题，那就不要去费时间纠结小问题了
如果不行，你再来这里问吧。。。。
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9楼2013-03-23 00:00:20
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