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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 酶活测定问题请教
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淡竹2066

铜虫 (小有名气)

[求助] 酶活测定问题请教

最近在做一个原核表达蛋白的酶活测定，具体是将镍柱纯化获得的蛋白通过与NADH偶联来检测其活性，为了确保实验的准确性，每次纯化的蛋白样品都做3个平行，结果没什么问题。但是不同批次纯化到的蛋白测定的酶活结果却不能很好的平行，这是为什么呢？纯化过程和酶活测定方法都是按照相同的步骤来做的。不知道有没有虫友也遇到过类似的问题。。。。求助！！！！急！！
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1楼 2013-01-18 19:24:05
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buggiegoat

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
淡竹2066: 金币+1 2013-01-19 00:05:27
三个平行样品经过一个或三个镍柱？有没先统一原核样品的量（OD值）呢？ 在加试剂时有没把试剂摇均？
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2楼2013-01-18 21:30:29
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淡竹2066

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by buggiegoat at 2013-01-18 21:30:29
三个平行样品经过一个或三个镍柱？有没先统一原核样品的量（OD值）呢？ 在加试剂时有没把试剂摇均？

1.三个平行样是同一批次纯化到的蛋白，测定没什么问题，现在的问题是批次间无法平行
2.至于你说的不同批次纯化前的原核样品的量（OD值）----是菌体浓度吗?这个我倒是没有测过，还有就是每次纯化到的蛋白含量之间也有一定的差别，这个对我测定的比活力影响大吗？
3.我都是将配好的反应体系摇匀后再反应的，这个应该没问题

因为我后面还要继续做点突变寻找酶的活性中心，所以希望现在把数据做稳定方便以后参考，但是现在我的批次间无法对应，那我以后每做一个点突变都得把原始的蛋白表达一次，那样太麻烦了。。。。。
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3楼2013-01-19 00:14:38
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buggiegoat

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

是的，菌体浓度。比如说你做三次实验，在纯化蛋白前，OD都调到1或你所设定的值。纯化后的蛋白，也测浓度，统一后才做活性测，如此便可知误差在那儿。希望能解惑。

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4楼2013-01-19 09:35:51
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buggiegoat

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-23 16:02:19
是的，菌体浓度。比如说你做三次实验，在纯化蛋白前，OD都调到1或你所设定的值。纯化后的蛋白，也测浓度，统一后才做活性测，如此便可知误差在那儿。希望能解惑。

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5楼2013-01-19 09:40:40
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buggiegoat

新虫 (初入文坛)
测定后再把结果告诉我。

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6楼2013-01-19 23:32:08
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Lester11

银虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
不同批次纯化得到的结果本身就会出现不少偏差，一般的纯化流程不可能有那么好的重复性
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Followyourheart!
7楼2013-01-20 00:12:27
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淡竹2066

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by buggiegoat at 2013-01-19 23:32:08
测定后再把结果告诉我。

嗯，好的。我也打算这两天再重复一次。。
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8楼2013-01-22 19:03:52
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buggiegoat

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

若有蛋白量，就能测出每单位蛋白有多少酶活量。。

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9楼2013-01-22 23:57:06
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千年一雨

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

不同批次的酶，如果酶活误差在20%以内是可以接受的。另外，如果酶放的时间不同，可能稳定性会受到影响，导致酶活不同。
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10楼2013-05-07 20:59:00
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