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daifeng

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[交流] 以NADH为底物的酶的酶活测定已有7人参与

NADH在340nm处有吸光值，我现在利用的酶能氧化NADH成NAD+,所以在测定该酶的酶活时，是利用其在340nm处吸光值的减小来算的，另外我用的是752型分光光度计，在测定中有几个疑问，想请教一下各位虫友：
1、吸光值降低到负值，对酶活的测定影响大吗？
2、在测定中每次吸光值都是降到-0.097，而且在加入一个物质时，酶活降低了将近50%，吸光值还是降到-0.097，这是什么原因呢？
3、在后面的实验中，又发现的是：空白对照后，在放入样品前，发现其吸光值也是-0.097，那么对“2、”能给出的是什么结论呢？
我在这先谢过各位虫友啦^_^

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1楼 2009-11-09 10:48:04

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daifeng

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NADH为底物的酶活测定

引用回帖:

Originally posted by qianggene at 2009-11-09 17:08:06:
我也做这方面的实验，只不过是NADPH，我的难题是：反应时间该多久比较合适，才能比较精确的测出酶活？

NOX酶活测定的反应体系：反应液总体积 3.2mL，含有0.1M的磷酸钾缓冲浓液（pH7.0）、1mM的DTT、加入20mM NADH 25μl后于30℃保温10min，再加入200μl酶液，以固定的频率快速振荡之后，通过紫外分光光度计于和340nm下连续跟踪其吸光度的变化，连续测1 min，每隔6 s读取数据。活力定义为：在上述条件下，每分钟氧化1 μmol NADH所需的酶量为1个单位。其酶活力单位的计算公式如下：
酶活力单位（U/mL）＝（ Vt* ⊿A/⊿t) /（e*L* Vs ） (式2-1)
Vt ：反应液总体积，本实验为3mL；
Vs ：样品体积，本实验为0.20mL；
e : 摩尔吸光系数，NADH在340 nm处的毫摩尔消光系数为6.22；
L ：比色杯光径 (cm)，本实验中采用光径1.0cm比色杯；
⊿A/⊿t：每分钟吸光度变化值，实际根据初速度法取酶促反应第一分钟的⊿A，先后测3个平行样取平均值；
比活力 (U/mg)：酶活 (U/mL) 与蛋白浓度 (mg/mL) 的比值。
由上所述，NOX活力单位（U/mL）=2.6×(⊿A/min)。

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6楼2010-05-18 21:52:54

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红多多

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吸光是正值说明你的样品将光源的光吸收了一部分，要是为负值……是不是说你的样品有自发关现象？所以我觉得你是不是应该用你反应完了的样品，也就是NAD+（-0.097）的这个来调零，这样你在测定的值就是正值了。

另外你的问题1 可能会有影响，在负值时线性关系可能会不好。问题2 酶活降低，最终生成物浓度不变，这个说明你的酶量降低了一半，或者是有竞争性抑制剂在作用。问题3 这说明你的空白样有吸收，用NAD+（-0.097）调零试试吧，这个对2好像没什么影响吧。

个人观点，不一定正确，等待高人指点

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