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wangxuanxuan

铁杆木虫 (正式写手)

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[交流] 【求助】土壤脲酶活性测定中的问题已有38人参与

我现在测土壤中的脲酶活性，用的是比色法。结果发现无土对照的数值很大，不清楚是什么原因。请哪位做过这方面的给解释下，谢谢。
试验步骤：试剂：1）甲苯
2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。
3）柠檬酸盐缓冲液（PH6.7）：184克柠檬酸和147.5克氢氧化钾溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释至1000毫升。
4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5克苯酚溶于少量乙醇，加2毫升甲醇和18.5毫升丙酮，用乙醇稀释至100毫升（A），存于冰箱中；27克NaOH溶于100毫升水（B）。将AB溶液保存在冰箱中。使用前将2溶液各20毫升混合，用蒸馏水稀释至100毫升。
5）次氯酸钠溶液：用水稀释试剂，至活性氯的浓度为0.9%，溶液稳定。
6）氮的标准溶液：a 精确称取0.4717克硫酸铵溶于水并稀释至1000ml，得到1ml含有0.1mg氮的标准液
标准曲线绘制：吸取配置好的氮溶液20ml，定容至100ml，即稀释了5倍，吸取1，3，5，7，9，11，13ml移至50ml容量瓶，加水至20ml，再加入4ml苯酚钠，仔细混合，加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟,用水稀释至刻度。将着色液在紫外分光光度计上于578nm处进行比色测定，以标准溶液浓度为横坐标，以光密度值为纵坐标绘制曲线图。
1) 称取5g过1mm筛的风干土样于50ml容量瓶中。
2) 向容量瓶中加入1ml甲苯（以能全部使土样湿润为度）并放置15分钟
3) 之后加入10ml 10％尿素溶液和20ml柠檬酸缓冲液（PH6.7），并仔细混合
4) 将容量瓶放入38摄氏度恒温箱中，培养3h
5) 培养结束后，用热至38摄氏度水稀释至刻度，仔细摇荡，并将悬液用致密滤纸过滤于三角瓶中。
6) 显色：吸取1ml滤液于50ml容量瓶中，加入10ml蒸馏水，充分震荡，然后加入4ml苯酚钠，仔细混合，再加入3ml次氯酸钠，充分摇荡，放置20分钟，用水稀释至刻度，溶液呈现（青定）酚的蓝色。
7) 1h内在（（青定）酚的蓝色在1h内保持稳定）在分光光度计上用1cm液槽，于578nm处将显色液进行比色测定。
8) 无土对照：不加土样，其他操作与样品实验相同。以检验试剂纯度，整个实验设置一个对照
9)无基质对照：以等体积的水代替基质，其他操作与样品实验相同。每个土样都设此对照。

结果计算：土壤脲酶活性以24小时后100g土壤中NH3－N的毫克数表示。
M＝（X样品－X无土－X无基质）*100*10
式中：M－土壤脲酶活性值
X样品――样品实验的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫克数
X无土――无土对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫克数
X无基质――无基质对照实验中的光密度值在标准曲线上对应的NH3－N毫克数
100 ――样品定容的体积与测定时吸取量的比值
10 ――酶活性单位的土重与样品土重之比值

[ Last edited by wangxuanxuan on 2010-3-21 at 21:24 ]

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1楼 2010-03-21 21:22:47

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zhwh70

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脲酶的测定中次氯酸钠的作用是什么？因为购买的次氯酸钠溶液中氯的浓度不是确定的，如何保证氯的浓度是0.9%

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11楼2012-02-10 15:05:34

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lxfjdxh

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LZ你好，我做实验曾经遇到过几乎一模一样的问题。后来经过改进，结果便好了。
主要原因：培养时间太短，稀释倍数太大。
1、培养3h是远远不够的，要培养24h。
2、培养结束后，不要加水到刻度线，直接过滤提取1ml就行了。
3、我做的是亚热带常绿阔叶林的土壤，标准曲线的浓度设定得很好，结果基本都在曲线的浓度之内。

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22楼2012-12-03 11:22:29

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