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淡竹2066

铜虫 (小有名气)

[求助] 酶活测定问题请教

最近在做一个原核表达蛋白的酶活测定,具体是将镍柱纯化获得的蛋白通过与NADH偶联来检测其活性,为了确保实验的准确性,每次纯化的蛋白样品都做3个平行,结果没什么问题。但是不同批次纯化到的蛋白测定的酶活结果却不能很好的平行,这是为什么呢?纯化过程和酶活测定方法都是按照相同的步骤来做的。不知道有没有虫友也遇到过类似的问题。。。。求助!!!!急!!
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淡竹2066

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
2楼: Originally posted by buggiegoat at 2013-01-18 21:30:29
三个平行样品经过一个或三个镍柱?有没先统一原核样品的量(OD值)呢? 在加试剂时有没把试剂摇均?

1.三个平行样是同一批次纯化到的蛋白,测定没什么问题,现在的问题是批次间无法平行
2.至于你说的不同批次纯化前的原核样品的量(OD值)----是菌体浓度吗?这个我倒是没有测过,还有就是每次纯化到的蛋白含量之间也有一定的差别,这个对我测定的比活力影响大吗?
3.我都是将配好的反应体系摇匀后再反应的,这个应该没问题

因为我后面还要继续做点突变寻找酶的活性中心,所以希望现在把数据做稳定方便以后参考,但是现在我的批次间无法对应,那我以后每做一个点突变都得把原始的蛋白表达一次,那样太麻烦了。。。。。
3楼2013-01-19 00:14:38
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buggiegoat

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖


感谢参与,应助指数 +1
淡竹2066: 金币+1 2013-01-19 00:05:27
三个平行样品经过一个或三个镍柱?有没先统一原核样品的量(OD值)呢? 在加试剂时有没把试剂摇均?
2楼2013-01-18 21:30:29
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buggiegoat

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

是的,菌体浓度。比如说你做三次实验,在纯化蛋白前,OD都调到1或你所设定的值。纯化后的蛋白,也测浓度,统一后才做活性测,如此便可知误差在那儿。希望能解惑。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
4楼2013-01-19 09:35:51
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buggiegoat

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2013-01-23 16:02:19
是的,菌体浓度。比如说你做三次实验,在纯化蛋白前,OD都调到1或你所设定的值。纯化后的蛋白,也测浓度,统一后才做活性测,如此便可知误差在那儿。希望能解惑。

[ 发自手机版 http://muchong.com/3g ]
5楼2013-01-19 09:40:40
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