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淡竹2066

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[求助] 酶活测定问题请教

最近在做一个原核表达蛋白的酶活测定，具体是将镍柱纯化获得的蛋白通过与NADH偶联来检测其活性，为了确保实验的准确性，每次纯化的蛋白样品都做3个平行，结果没什么问题。但是不同批次纯化到的蛋白测定的酶活结果却不能很好的平行，这是为什么呢？纯化过程和酶活测定方法都是按照相同的步骤来做的。不知道有没有虫友也遇到过类似的问题。。。。求助！！！！急！！

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1楼2013-01-18 19:24:05

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淡竹2066

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引用回帖:

2楼: Originally posted by buggiegoat at 2013-01-18 21:30:29
三个平行样品经过一个或三个镍柱？有没先统一原核样品的量（OD值）呢？在加试剂时有没把试剂摇均？

1.三个平行样是同一批次纯化到的蛋白，测定没什么问题，现在的问题是批次间无法平行
2.至于你说的不同批次纯化前的原核样品的量（OD值）----是菌体浓度吗?这个我倒是没有测过，还有就是每次纯化到的蛋白含量之间也有一定的差别，这个对我测定的比活力影响大吗？
3.我都是将配好的反应体系摇匀后再反应的，这个应该没问题

因为我后面还要继续做点突变寻找酶的活性中心，所以希望现在把数据做稳定方便以后参考，但是现在我的批次间无法对应，那我以后每做一个点突变都得把原始的蛋白表达一次，那样太麻烦了。。。。。