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请教脂肪酶活性测定
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大家好，问个酶学的基本问题。 我利用分光光度计法pNPB测脂肪酶活性，测405nm处连续光吸收，根据初速度得到斜率，请问如何根据斜率来计算酶活结果，非常感谢！ |
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 生工检测理论与实务 |
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jinpeng_6118
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【答案】应助回帖
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利用分光光度计法pNPB测脂肪酶活性，酶比活计算公式如下： Beer定律的数学表达式为A=kbc， 摩尔吸光系数：公式A=kbc中的以为1mol/L,b为1cm时，则系数k称为摩尔吸光系数，以ε表示，单位为升/（摩尔•厘米）[L/(mol•cm）]，A=kbc可写成A=εc。 A:吸光值 c：pNP浓度 mol/L ε：摩尔吸光系数 t：时间 min V：反应体系体积 L △ M：pNP生成总量 单位mol 我们的b=1cm 因而公式：A=cε 所以我们测得的动力学曲线斜率△A/t=ε△c/t=ε△M/tV △M/t=△A V /tε 。△M/t：每分钟PNP的生成（mol/min），等同于每分钟pNPB的分解量 1个酶活力单位定义为1分钟水解底物生成1μmol对硝基苯酚(胺)所需要的酶量 所以酶比活计算公式：U/mg=10（6次方）x△A V /tεM=10（6次方）x K V/εM K为斜率，M为酶的加入量（单位mg），V为测定时的体积（L），ε：摩尔吸光系数0.016×106 L/(mol•cm) |
9楼2012-01-08 22:27:34
2楼2011-08-22 22:59:53
3楼2011-08-23 08:32:13
imfly77
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【答案】应助回帖
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lstt09nk(金币+3): 鼓励交流，欢迎常来 2011-08-23 13:27:36
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1分子的pNPB水解生成1分子的pNP（对硝基苯酚），pNP在405 nm下有特异性吸收，对应有个摩尔消光系数ε（比如18.8 cm2/μmol，不同的文献值会有略微差别，也可以你自己用pNP标准品标定。一般来说选一个值，然后注明参考文献就行了），按下面这个式子计算酶活：U=（斜率×稀释倍数）/（光程×摩尔消光系数） 其中： 斜率就是酶标仪读书，注意通常酶标仪读数单位是10^-3 min-1； 光程就是溶液最低处的厚度，需要量一下； 稀释倍数是指体系体积与酶的加入量的比，比如200 ul体系+5 ul酶，稀释倍数就是41. 最后注意检查一下所有物理量的量纲要统一。 |
4楼2011-08-23 08:39:09
muchong5577
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看天(金币+5, BioEPI+1): 鼓励热心回答 2011-08-26 12:53:19
看天(金币+5, BioEPI+1): 鼓励热心回答 2011-08-26 12:53:19
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脂肪酶活性测定 1 pNP-乙腈-丙酮标准曲线的构建： 原液：将pNP溶解与PBS（PH6.5,0.01M）和乙腈，丙酮溶液中。 稀释液：及与配置原液时相同体积的PBS，乙腈，丙酮溶液。 10ml测试体系：原液投入量+稀释液投入量 = 10ml 空白对照：稀释液10ml 8组测试组：原液不同投入梯度+ 相应稀释液 = 10ml. 测OD405,得到标准曲线方程y = A x + B,和斜率 2 脂肪酶的酶活测定: Lipase 的游离酶的酶活测定: 第一步:称取 Lipase 干粉(精酶),用10ml PH6.5 0.01m的PBS溶解保存. 第二步:移取上面配制的酶液50ul于摇瓶中,再加入PH 6.5 0.01m的PBS 2.8ml,在摇床中37度,150rpm 条件下震荡几分钟后加入10mM 的对硝基苯酚乙酯150ul,加入后立即计时三分钟反应.。 第三步:三分钟反应结束后立即加入丙酮3ml终止反应,继续震荡几分钟后过滤,取滤液静态测OD405 值. 空白配制：PH 6.5 0.01m的PBS 2.85ml+对硝基苯酚乙酯+丙酮 3 比活力计算 将测得的0D405，代入标准曲线方程，根据活力测定反应体积，脂肪酶蛋白浓度和反应时间，得到比活力：X um/min/mg |
6楼2011-08-26 12:44:57
swqowen
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