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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 请教脂肪酶活性测定
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camen

新虫 (初入文坛)

[求助] 请教脂肪酶活性测定

大家好，问个酶学的基本问题。
我利用分光光度计法pNPB测脂肪酶活性，测405nm处连续光吸收，根据初速度得到斜率，请问如何根据斜率来计算酶活结果，非常感谢！
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1楼 2011-08-22 21:29:02
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

jinpeng_6118

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
利用分光光度计法pNPB测脂肪酶活性，酶比活计算公式如下：
Beer定律的数学表达式为A=kbc，
摩尔吸光系数：公式A=kbc中的以为1mol/L,b为1cm时，则系数k称为摩尔吸光系数，以ε表示，单位为升/（摩尔•厘米）[L/(mol•cm）]，A=kbc可写成A=εc。
A:吸光值
c：pNP浓度     mol/L
ε：摩尔吸光系数  
t：时间            min
V：反应体系体积    L
△        M：pNP生成总量 单位mol
我们的b=1cm
因而公式：A=cε
所以我们测得的动力学曲线斜率△A/t=ε△c/t=ε△M/tV
△M/t=△A V /tε  。△M/t：每分钟PNP的生成（mol/min），等同于每分钟pNPB的分解量
1个酶活力单位定义为1分钟水解底物生成1μmol对硝基苯酚(胺)所需要的酶量
所以酶比活计算公式：U/mg=10（6次方）x△A V /tεM=10（6次方）x K V/εM
        K为斜率，M为酶的加入量（单位mg），V为测定时的体积（L），ε：摩尔吸光系数0.016×106 L/(mol•cm)
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人生百态原为海，看破红尘方为岸！
9楼2012-01-08 22:27:34
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普通回帖

camen

新虫 (初入文坛)
希望有知道的朋友帮帮忙，谢谢！
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2楼2011-08-22 22:59:53
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看天

木虫 (知名作家)
你是在标准的1cm光径的比色皿中吗？
什么物质的吸光度？如果是NADH的查询摩尔吸光系数
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戒嗔怒以养肝气，省言语以养神气，多读书以养质气，顺时令以养元气，不拘节以养大气，观天变以养灵气，莫强求规于运气。
3楼2011-08-23 08:32:13
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imfly77

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
lstt09nk(金币+3): 鼓励交流，欢迎常来 2011-08-23 13:27:36
1分子的pNPB水解生成1分子的pNP（对硝基苯酚），pNP在405 nm下有特异性吸收，对应有个摩尔消光系数ε（比如18.8 cm2/μmol，不同的文献值会有略微差别，也可以你自己用pNP标准品标定。一般来说选一个值，然后注明参考文献就行了），按下面这个式子计算酶活：U=（斜率×稀释倍数）/（光程×摩尔消光系数）
其中：
斜率就是酶标仪读书，注意通常酶标仪读数单位是10^-3 min-1；
光程就是溶液最低处的厚度，需要量一下；
稀释倍数是指体系体积与酶的加入量的比，比如200 ul体系+5 ul酶，稀释倍数就是41.
最后注意检查一下所有物理量的量纲要统一。
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4楼2011-08-23 08:39:09
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muchong5577

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
lstt09nk(金币+2): 感谢参与 2011-08-23 13:27:48
脂肪酶是在油水界面催化反应，机理不同于其它单一相的酶类，其反应不符合传统的酶促动力学方程（有文献报道过），根据初速度计算酶活不科学。建议楼主采用pNPB加标准曲线法。
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5楼2011-08-23 08:49:16
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cexoihtydx

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★
看天(金币+5, BioEPI+1): 鼓励热心回答 2011-08-26 12:53:19
脂肪酶活性测定
1 pNP-乙腈-丙酮标准曲线的构建：
原液：将pNP溶解与PBS（PH6.5,0.01M）和乙腈，丙酮溶液中。
稀释液：及与配置原液时相同体积的PBS，乙腈，丙酮溶液。
10ml测试体系：原液投入量+稀释液投入量 = 10ml
空白对照：稀释液10ml
8组测试组：原液不同投入梯度+ 相应稀释液 = 10ml.
测OD405,得到标准曲线方程y = A x + B,和斜率
2 脂肪酶的酶活测定:
Lipase 的游离酶的酶活测定:
第一步:称取 Lipase 干粉(精酶),用10ml PH6.5 0.01m的PBS溶解保存.
第二步:移取上面配制的酶液50ul于摇瓶中,再加入PH 6.5 0.01m的PBS 2.8ml,在摇床中37度,150rpm 条件下震荡几分钟后加入10mM 的对硝基苯酚乙酯150ul,加入后立即计时三分钟反应.。
第三步:三分钟反应结束后立即加入丙酮3ml终止反应,继续震荡几分钟后过滤,取滤液静态测OD405 值.
空白配制：PH 6.5 0.01m的PBS 2.85ml+对硝基苯酚乙酯+丙酮
3 比活力计算
将测得的0D405，代入标准曲线方程，根据活力测定反应体积，脂肪酶蛋白浓度和反应时间，得到比活力：X um/min/mg
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不放弃，日子总有阳光，追求总有希望！
6楼2011-08-26 12:44:57
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swqowen

金虫 (职业作家)

勋章归天
这方面的文献很多，楼主多查查，
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7楼2011-08-26 19:49:13
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swqowen

金虫 (职业作家)

勋章归天
我是做其他酶活性测试的，只要生物书很多的，
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8楼2011-08-26 19:49:48
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yufei6915

木虫 (著名写手)

飞
引用回帖:
9楼: Originally posted by jinpeng_6118 at 2012-01-08 22:27:34
利用分光光度计法pNPB测脂肪酶活性，酶比活计算公式如下：
Beer定律的数学表达式为A=kbc，
摩尔吸光系数：公式A=kbc中的以为1mol/L,b为1cm时，则系数k称为摩尔吸光系数，以ε表示，单位为升/（摩尔•厘米）， ...

您好！ 我是做这方面实验的研究生，现在准备些毕业论文，也遇到了这样的问题。根据您的回答，我理解了这几个公式，现在有个问题是这样的，我做的反应体系是100微升，是用酶标仪测的OD405nm。因为根据您最后的公式：U/mg=10（6次方）x△A V /tεM=10（6次方）x K V/εM，测得的脂肪酶活力只与A，V，t，和ε有关，与我底物的C物质的量浓度没有关系了。  我的问题是，我的底物浓度是0.5mmol/L不是1mol/L，反应用的不是比色皿，b不是1cm，那我如何用摩尔消光系数 计算酶活力呢？谢谢！
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goodluckformyself~~
10楼2014-06-24 21:41:45
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