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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 【求助/交流】微生物纤维素酶活测定
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raulwen2002

木虫 (小有名气)

[交流] 【求助/交流】微生物纤维素酶活测定 已有7人参与

请教各位大侠一个问题，本人目前在做纤维素降解菌对木薯渣的降解效果。使用的菌是从菌种保藏中心购买的高效纤维素降解菌，采用的方法是DNS显色，用分光光度计测定CMC酶活和滤纸酶活时，失活酶的测定值却高于酶酶解反应后的值，请问谁知道可能是什么原因啊？谢谢啦！
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1楼 2010-05-13 12:13:00
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫
★
1949stone(金币+1):谢谢 2010-05-14 13:25:43
你的产物里面含有还原性糖，失活酶的测定值应该是这个原因。
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仕不可不弘毅，任重而道远
2楼2010-05-13 15:08:04
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普通回帖

zhjp326

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
1949stone(金币+2):信息交流经验 2010-05-14 13:25:54
测还原糖的方法很多的，找一个灵敏的试试，比如铁氰化钾法，或者其他方法，可能会有用，DNS法灵敏度不够高，不过它操作简单方便，所以大家都用。
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3楼2010-05-13 16:50:00
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raulwen2002

木虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 墨香若水 at 2010-05-13 15:08:04:
你的产物里面含有还原性糖，失活酶的测定值应该是这个原因。

但没有失活的酶液里也有还原性糖啊，因为酶液都是一样的，只是存在失活和不失活的区别，怎么会出现失活酶的吸光度要高于没有失活酶的吸光度呢
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4楼2010-05-14 09:47:07
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s1d2w2

木虫 (正式写手)
菲林法有快捷又简单。生物发酵上经常用这个方法测你的还原糖
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5楼2010-05-14 13:21:33
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muchong5577

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
scelab(金币+3):欢迎多来交流！:tiger06: 2010-05-14 21:13:47
raulwen2002(金币+1): 2010-05-16 20:53:17
目前通常以羧甲基纤维素钠盐（简称CMCNa）作为纤维素酶作用的底物。但需要指出的是CMCNa无论在结构上还是在性质上都不同于天然纤维素，天然纤维素不溶于水，而CMCNa有很强的亲水性，非常容易被纤维素酶分解。在相同条件下，同一种纤维素酶分解CMCNa所产生的还原糖远大于水解天然纤维素所产生的还原糖。     
        纤维素酶水解羧甲基纤维素钠（CMCNa,[C6H9O5 (CH2COONa)]n）释放的羧甲基还原糖，与碱性条件下的DNS试剂发生反应，生成红棕色的氨基化合物，该化合物在540nm下有最大光吸收，由此，可根据测得的吸光值与葡萄糖浓度的关系来计算纤维素酶的活力（CMCA）。

[ Last edited by muchong5577 on 2010-5-14 at 20:21 ]
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6楼2010-05-14 20:19:12
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zhangjiewtt

金虫 (小有名气)
★ ★
scelab(金币+2):热心虫友，欢迎多来交流~~~:tiger06::tiger28::tiger23: 2010-05-15 00:56:07
纤维素酶是一种多组分酶，包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成葡萄糖。纤维素酶水解纤维素产生的纤维二糖、葡萄糖等还原糖能将碱性条件下的3,5-二硝基水杨酸（DNS）还原，生成棕红色的氨基化合物，在540nm波长处有最大光吸收，在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度呈比例关系，利用比色法测定其还原糖生成的量就可测定纤维素酶的活力。
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7楼2010-05-14 21:25:53
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段家一凡

木虫 (正式写手)
★ ★
plantaqp(金币+2):欢迎交流 2010-05-16 01:45:04
raulwen2002(金币+2): 2010-05-16 20:53:55
引用回帖:
Originally posted by zhangjiewtt at 2010-05-14 21:25:53:
纤维素酶是一种多组分酶，包括C1酶、CX酶和β-葡萄糖苷酶三种主要组分。其中C1酶的作用是将天然纤维素水解成无定形纤维素，CX酶的作用是将无定形纤维素继续水解成纤维寡糖，β-葡萄糖苷酶的作用是将纤维寡糖水解成 ...

C1，CX已是比较古代的说法了。
测纤维素酶活性，偶尔会出现对照的吸光值比酶反应的还高的情况，一般是差不多。你可以延长反应时间或增加酶量或同时增加，应该能看到酶活，如果还没有，只能说明你购买的菌不好，或者是你的发酵条件不适于纤维素酶的产生。你可以再摸索产酶的条件。
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8楼2010-05-14 23:45:22
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫
★
plantaqp(金币+1):欢迎交流 2010-05-16 01:45:22
raulwen2002(金币+2):以前用稻草杆为唯一碳源发酵时，很少出现这种情况，现在用木薯渣出现这种情况的时候很多 2010-05-16 20:55:16
引用回帖:
Originally posted by raulwen2002 at 2010-05-14 09:47:07:

   但没有失活的酶液里也有还原性糖啊，因为酶液都是一样的，只是存在失活和不失活的区别，怎么会出现失活酶的吸光度要高于没有失活酶的吸光度呢

你是测一次出现这种状况 还是一直都市这种现象。 DNS法测酶活灵敏度相对较低，是mg级。
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仕不可不弘毅，任重而道远
9楼2010-05-15 23:00:03
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墨香若水

木虫 (著名写手)

小小囧虫
raulwen2002(金币+2): 2010-05-17 08:55:39
引用回帖:
Originally posted by 墨香若水 at 2010-05-15 23:00:03:



你是测一次出现这种状况 还是一直都市这种现象。 DNS法测酶活灵敏度相对较低，是mg级。

个人觉得还是你培养基的原因。你应该做一个不加菌种的培养基做对照看看。
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仕不可不弘毅，任重而道远
10楼2010-05-16 21:12:21
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