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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 大肠杆菌转化
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lb3522922

铜虫 (小有名气)

[求助] 大肠杆菌转化

最近在做载体构建、转化大肠杆菌的实验，具体流程是先准备好pMD19T-A与pET-28a载体，我要将A插入pET-28a做表达，两个载体同时酶切，回收目的条带，酶联过夜，转化DH5a感受态细胞。现在问题是，转化子长了挺多，但是有大有小，挑几个做菌落PC鉴定，有目的大小的条带，但是有时候弱，有时候强，然后活化菌提质粒，电泳结果是条带有时候大小不正确，有时候干脆没有。后来还发现转化子的平板在室温下放置2天，菌落就会长的很大，像是酵母。重复了很多次，换了限制性内切酶、连接酶、感受态细胞，但是最终还是失败，请各位同行赐教，万分感谢！
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1楼 2012-12-29 10:38:56
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Renavatio

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议做PCR检测的时候，在平板上取一下背景作为模板，一般那种比较弱的条带都是转化的时候加的质粒！
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Undefined！
10楼2012-12-30 23:14:26
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cicelyzh

铁杆木虫 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
如果菌落大小不正常多半是感受态不好。如果菌落疯长，很可能是污染了其它菌。往往这种污染的菌根本提不出质粒。我怀疑你的感受态细胞或者是LB污染了。
还有就是菌落PCR条带有弱有强是正常的，因为模板量很难控制。所以一般菌落PCR用于快速筛选，最后还是要提质粒做酶切鉴定的。
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2楼2012-12-29 11:09:04
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lb3522922

铜虫 (小有名气)
我刚开始也认为是感受态的问题，就换了一批，可是还是出现同样的问题。LB也是现配现用的。真不知道究竟是哪里出了问题。
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3楼2012-12-29 12:13:08
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wen1023tao

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
kx444555: 金币+2, 鼓励交流 2013-01-04 13:49:14
长大小不一的菌落，应该是染杂菌了
可能是感受态染杂菌了，换新做的，做的时候仔细些，或者多挑几个（六个菌落左右）在一个管子里面摇菌，因为感受态是在无菌培养基中培养，没有抗性，多挑几个利用种群竞争来抗下杂菌生长，或者直接去买感受态
也可能是做转化过程染菌了，建议在 超净台操作
还可能是抗生素失效了，或者部分失效，导致有小菌落的杂菌生长，建议换抗生素或者加大抗生素浓度
至于平板在室温下长得很大应该是正常的，一般都储层在4度左右，室温25度，大肠杆菌的繁殖速度还是很快的
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4楼2012-12-29 14:02:52
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