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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » Q-pcr熔解曲线
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yanjiwuluo

新虫 (小有名气)

[求助] Q-pcr熔解曲线

请问各位高手，我初做Q-pcr，跑的线，为什么呢一开始就上升呢。就是CT值2.5左右。还有熔解曲线有两个相近的峰。是不是DNA模板浓度太大了。。。
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1楼 2012-12-20 09:52:16
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

孙启亮

金虫 (著名写手)
不应该是模板的问题，整理下上图吧
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2楼2012-12-20 11:32:35
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yanjiwuluo

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-12-20 11:32:35
不应该是模板的问题，整理下上图吧

看看我得扩增曲线，跟熔解曲线

1.png



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4楼2012-12-20 17:47:32
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dongrh1981

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-12-24 18:55:40
和上面的虫子意见一样：引物特异性不好，建议提高退火温度，最彻底的办法就是重新设计引物。
如果实在是不能换引物，那就尝试一些小花招：改变PCR buffer 的严谨性；换用热启动酶；或者荧光PCR反应时先走10个退火温度为60度的循环，再走30个退火温度为55度的循环。
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呼吸的痛
9楼2012-12-21 11:54:40
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普通回帖

yanjiwuluo

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 孙启亮 at 2012-12-20 11:32:35
不应该是模板的问题，整理下上图吧

好欢喜，在别的帖子上看过you。哈哈，好之后我把图传上
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3楼2012-12-20 12:33:46
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昺昺

木虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
yanjiwuluo: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-12-21 12:12:39
应该是引物特异性的问题，我建议将退火温度提高
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太阳出来，星星要走。
5楼2012-12-20 20:45:50
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stewart3261

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
yanjiwuluo: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-12-21 12:14:56
小丹木木: 金币+2, 鼓励应助 2012-12-24 18:56:10
这样的扩增曲线是没有问题的，可以说还不错的。问题是熔解曲线不太好！有杂峰，表明有非特异性的扩增！解决办法，你可以再跑一次，确定引物能不能用。还有确保你RNA的质量！
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6楼2012-12-21 09:00:23
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stewart3261

铜虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

忘记一点，可以做一个退火温度梯度
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7楼2012-12-21 09:01:20
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孙启亮

金虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
yanjiwuluo: 金币+1, ★★★很有帮助 2012-12-21 12:16:51
引物特异性有问题，按理说你的引物退火温度在55度也不算低，建议你提高下退火温度，若杂峰仍没消除，重新设计引物吧
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8楼2012-12-21 09:24:57
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yanjiwuluo

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by stewart3261 at 2012-12-21 09:00:23
这样的扩增曲线是没有问题的，可以说还不错的。问题是熔解曲线不太好！有杂峰，表明有非特异性的扩增！解决办法，你可以再跑一次，确定引物能不能用。还有确保你RNA的质量！

我提的是DNA，我之前做过一个退火温度的梯度。然后54度是比较好的。怎么用55度Q-pcr时。熔解曲线就不好了
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10楼2012-12-21 12:14:47
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