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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 存档旧帖 » Q-pcr熔解曲线
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yanjiwuluo

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by dongrh1981 at 2012-12-21 11:54:40
和上面的虫子意见一样：引物特异性不好，建议提高退火温度，最彻底的办法就是重新设计引物。
如果实在是不能换引物，那就尝试一些小花招：改变PCR buffer 的严谨性；换用热启动酶；或者荧光PCR反应时先走10个退火温 ...

好的，我试试你的绝招，谢谢
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11楼2012-12-21 12:16:24
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stewart3261

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by yanjiwuluo at 2012-12-21 12:14:47
我提的是DNA，我之前做过一个退火温度的梯度。然后54度是比较好的。怎么用55度Q-pcr时。熔解曲线就不好了...

既然54度比较好，为什么要用55度？
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12楼2012-12-21 16:08:25
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jl860822

金虫 (正式写手)
引物特异性不太好，你跑胶看一下就知道了，估计两个条带
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13楼2012-12-22 10:52:27
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yanjiwuluo

新虫 (小有名气)
引用回帖:
12楼: Originally posted by stewart3261 at 2012-12-21 16:08:25
既然54度比较好，为什么要用55度？...

因为其他的引物在55.56度左右，所以我就取了个中间值。
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14楼2012-12-23 14:18:23
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yanjiwuluo

新虫 (小有名气)
引用回帖:
13楼: Originally posted by jl860822 at 2012-12-22 10:52:27
引物特异性不太好，你跑胶看一下就知道了，估计两个条带

那该怎么办呢。难道要重新设计引物？我想着之前做的时候用同种引物特异性还挺好，不知道，这次用就又成两个峰了...是不是退火温度的事？
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15楼2012-12-23 14:20:22
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jl860822

金虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by yanjiwuluo at 2012-12-23 14:20:22
那该怎么办呢。难道要重新设计引物？我想着之前做的时候用同种引物特异性还挺好，不知道，这次用就又成两个峰了...是不是退火温度的事？...

你可以提高一下退火温度的
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16楼2012-12-23 20:42:27
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stewart3261

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
14楼: Originally posted by yanjiwuluo at 2012-12-23 14:18:23
因为其他的引物在55.56度左右，所以我就取了个中间值。...

你可以试一下别的引物在54度跑的怎么样！
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17楼2012-12-24 09:11:38
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yanjiwuluo

新虫 (小有名气)
引用回帖:
17楼: Originally posted by stewart3261 at 2012-12-24 09:11:38
你可以试一下别的引物在54度跑的怎么样！...

我发现我做了从50到62的温度梯度。每隔2度.看着54度最好，可以为什么用54度做q-pcr时，溶解曲线就又不怎么好了呢
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18楼2012-12-24 09:28:40
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