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yanjiwuluo

新虫 (小有名气)

引用回帖:
9楼: Originally posted by dongrh1981 at 2012-12-21 11:54:40
和上面的虫子意见一样:引物特异性不好,建议提高退火温度,最彻底的办法就是重新设计引物。
如果实在是不能换引物,那就尝试一些小花招:改变PCR buffer 的严谨性;换用热启动酶;或者荧光PCR反应时先走10个退火温 ...

好的,我试试你的绝招,谢谢
11楼2012-12-21 12:16:24
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stewart3261

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
10楼: Originally posted by yanjiwuluo at 2012-12-21 12:14:47
我提的是DNA,我之前做过一个退火温度的梯度。然后54度是比较好的。怎么用55度Q-pcr时。熔解曲线就不好了...

既然54度比较好,为什么要用55度?
12楼2012-12-21 16:08:25
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jl860822

金虫 (正式写手)


引物特异性不太好,你跑胶看一下就知道了,估计两个条带
13楼2012-12-22 10:52:27
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yanjiwuluo

新虫 (小有名气)

引用回帖:
12楼: Originally posted by stewart3261 at 2012-12-21 16:08:25
既然54度比较好,为什么要用55度?...

因为其他的引物在55.56度左右,所以我就取了个中间值。
14楼2012-12-23 14:18:23
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yanjiwuluo

新虫 (小有名气)

引用回帖:
13楼: Originally posted by jl860822 at 2012-12-22 10:52:27
引物特异性不太好,你跑胶看一下就知道了,估计两个条带

那该怎么办呢。难道要重新设计引物?我想着之前做的时候用同种引物特异性还挺好,不知道,这次用就又成两个峰了...是不是退火温度的事?
15楼2012-12-23 14:20:22
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jl860822

金虫 (正式写手)


引用回帖:
15楼: Originally posted by yanjiwuluo at 2012-12-23 14:20:22
那该怎么办呢。难道要重新设计引物?我想着之前做的时候用同种引物特异性还挺好,不知道,这次用就又成两个峰了...是不是退火温度的事?...

你可以提高一下退火温度的
16楼2012-12-23 20:42:27
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stewart3261

铜虫 (小有名气)

引用回帖:
14楼: Originally posted by yanjiwuluo at 2012-12-23 14:18:23
因为其他的引物在55.56度左右,所以我就取了个中间值。...

你可以试一下别的引物在54度跑的怎么样!
17楼2012-12-24 09:11:38
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yanjiwuluo

新虫 (小有名气)

引用回帖:
17楼: Originally posted by stewart3261 at 2012-12-24 09:11:38
你可以试一下别的引物在54度跑的怎么样!...

我发现我做了从50到62的温度梯度。每隔2度.看着54度最好,可以为什么用54度做q-pcr时,溶解曲线就又不怎么好了呢
18楼2012-12-24 09:28:40
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