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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于平末端连接
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liuwei0824

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于平末端连接已有3人参与

大家好！我最近在做平末端连接的实验，总是做不成功，求教~~
     载体是用smal1酶切的平末端，片段是双酶切的粘性末端，酶切后，载体进行去磷酸化，片段进行末端补平，然后进行连接反应（16℃过夜），然后转化，平板上都不长菌。。。。
   一开始载体是在30度酶切2h，片段在37度酶切2h，跑电泳后发现，载体只是部分被切开了，然后酶切时间就改成了过夜，结果都切没了，，，
   所有的酶都用的是Takara公司的。

   求高人指点啊！！！谢谢啦O(∩_∩)O~
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1楼2012-12-18 10:31:31
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

4楼说得很有道理！
你没有搞懂平末端化的原理就刚做这种“非主流”的克隆，勇气可嘉。
Klenow Fragment说到底是个DNA polymerase，相当于引物扩增，只能从5’-3‘方向进行。
大部分常用的限制性内切酶都是5'突出的，也就是缩进去的那个free的是3’末端，这样就可以补平
但是对于3‘突出的限制性内切酶，缩进去的是5’末端，这个就不能继续用Klenow Fragment的正向反应了。
解决之道很简单，就是Klenow Fragment还有一个3‘-5’的核酸外切酶活性，就是不加dNTP，可以把5‘突出的切平。
专业干这活的是T4 DNA polymerase，活性比Klenow Fragment高很多，但是我一直就用Klenow也行。
我喜欢在切片之后再加点dNTP让它补平，因为切到平齐的时候实际上进行的是一个交换反应。

但是，如果你说酶切过夜，载体就没了，这个相当不正常。
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6楼2014-03-25 19:43:13
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-24 19:04:58
引用回帖:
3楼: Originally posted by liuwei0824 at 2012-12-21 16:15:17
谢谢你O(∩_∩)O~
片段酶切用的是sacI和 salI，粘性末端5‘突出和3’突出会有很大的区别吗？
下次准备做不去磷酸化的对照，O(∩_∩)O~
但是这一次的实验还是很失败...

粘性末端补平应该是用聚合酶孵化，而聚合酶大多是有方向性的，如果是3’粘性末端，好像是不行的，当然也要看你用的是什么聚合酶。
我刚查了一下，SacI是3‘粘性末端，你做不出结果，问题可能在这。
建议你还是换个酶切位点。
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4楼2012-12-24 12:35:12
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781055707

木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

你可以在你的目的片段的引物上加平末端酶切位点，这样就不用多一步末端补平了，分子实验，操作步骤不要太多，能简就减。
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采菊东篱下，悠然见南山。
14楼2017-05-04 08:44:58
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普通回帖

zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-24 19:04:41
片段的双酶切用的是哪两个酶？看一下酶切后的粘性末端是5‘突出还是3’突出。还有就是一个转化子都不长，可能是去磷酸化很干净，或者有可能是感受态不好，建议做个不去磷酸化的线性质粒做连接、转化做阳性对照。
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2楼2012-12-18 12:23:31
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liuwei0824

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-18 12:23:31
片段的双酶切用的是哪两个酶？看一下酶切后的粘性末端是5‘突出还是3’突出。还有就是一个转化子都不长，可能是去磷酸化很干净，或者有可能是感受态不好，建议做个不去磷酸化的线性质粒做连接、转化做阳性对照。

谢谢你O(∩_∩)O~
片段酶切用的是sacI和 salI，粘性末端5‘突出和3’突出会有很大的区别吗？
下次准备做不去磷酸化的对照，O(∩_∩)O~
但是这一次的实验还是很失败
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3楼2012-12-21 16:15:17
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ytetyio09

新虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

可以试试这篇论文的方法，虽然是个小的改进，但是值得一试，而且很方便：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24613256
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5楼2014-03-25 19:07:03
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by ytetyio09 at 2014-03-25 19:07:03
可以试试这篇论文的方法，虽然是个小的改进，但是值得一试，而且很方便：
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24613256

这paper是你发的么？
到处贴！
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7楼2014-03-25 19:44:10
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那雨那女孩

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by biostar2009 at 2014-03-25 19:43:13
4楼说得很有道理！
你没有搞懂平末端化的原理就刚做这种“非主流”的克隆，勇气可嘉。
Klenow Fragment说到底是个DNA polymerase，相当于引物扩增，只能从5’-3‘方向进行。
大部分常用的限制性内切酶都是5'突出 ...

大神，求帮忙
我最近也要做平末端连接，但是不知道平末端连接后在目的基因及载体的两端个多加了几个碱基，会影响我的阅读框吗？
赞一下 回复此楼
辟邪
8楼2016-01-15 10:39:14
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 那雨那女孩 at 2016-01-15 10:39:14
大神，求帮忙
我最近也要做平末端连接，但是不知道平末端连接后在目的基因及载体的两端个多加了几个碱基，会影响我的阅读框吗？...

神马玩意乱七八糟的。。。你哪里飞出来的“多加了几个碱基”？话说说清楚
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9楼2016-01-15 14:33:35
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那雨那女孩

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by biostar2009 at 2016-01-15 14:33:35
神马玩意乱七八糟的。。。你哪里飞出来的“多加了几个碱基”？话说说清楚...

就是用平末端连接后，目的基因和载体之间会不会多出来的碱基（除了补平，会不会多加碱基），平末端连接是不定向的吗？之后该怎么筛选？大神
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辟邪
10楼2016-01-15 18:08:06
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