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liuwei0824新虫 (初入文坛)
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[求助]
关于平末端连接 已有3人参与
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大家好！我最近在做平末端连接的实验，总是做不成功，求教~~ 载体是用smal1酶切的平末端，片段是双酶切的粘性末端，酶切后，载体进行去磷酸化，片段进行末端补平，然后进行连接反应（16℃过夜），然后转化，平板上都不长菌。。。。 一开始载体是在30度酶切2h，片段在37度酶切2h，跑电泳后发现，载体只是部分被切开了，然后酶切时间就改成了过夜，结果都切没了，，， 所有的酶都用的是Takara公司的。 求高人指点啊！！！谢谢啦O(∩_∩)O~ |
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【答案】应助回帖
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4楼说得很有道理！ 你没有搞懂平末端化的原理就刚做这种“非主流”的克隆，勇气可嘉。 Klenow Fragment说到底是个DNA polymerase，相当于引物扩增，只能从5’-3‘方向进行。 大部分常用的限制性内切酶都是5'突出的，也就是缩进去的那个free的是3’末端，这样就可以补平 但是对于3‘突出的限制性内切酶，缩进去的是5’末端，这个就不能继续用Klenow Fragment的正向反应了。 解决之道很简单，就是Klenow Fragment还有一个3‘-5’的核酸外切酶活性，就是不加dNTP，可以把5‘突出的切平。 专业干这活的是T4 DNA polymerase，活性比Klenow Fragment高很多，但是我一直就用Klenow也行。 我喜欢在切片之后再加点dNTP让它补平，因为切到平齐的时候实际上进行的是一个交换反应。 但是，如果你说酶切过夜，载体就没了，这个相当不正常。 |
6楼2014-03-25 19:43:13
zhaodahe
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2楼2012-12-18 12:23:31
liuwei0824
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3楼2012-12-21 16:15:17
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4楼2012-12-24 12:35:12
