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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 关于平末端连接
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liuwei0824

新虫 (初入文坛)

[求助] 关于平末端连接已有3人参与

大家好！我最近在做平末端连接的实验，总是做不成功，求教~~
     载体是用smal1酶切的平末端，片段是双酶切的粘性末端，酶切后，载体进行去磷酸化，片段进行末端补平，然后进行连接反应（16℃过夜），然后转化，平板上都不长菌。。。。
   一开始载体是在30度酶切2h，片段在37度酶切2h，跑电泳后发现，载体只是部分被切开了，然后酶切时间就改成了过夜，结果都切没了，，，
   所有的酶都用的是Takara公司的。

   求高人指点啊！！！谢谢啦O(∩_∩)O~
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1楼2012-12-18 10:31:31
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biostar2009

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

4楼说得很有道理！
你没有搞懂平末端化的原理就刚做这种“非主流”的克隆，勇气可嘉。
Klenow Fragment说到底是个DNA polymerase，相当于引物扩增，只能从5’-3‘方向进行。
大部分常用的限制性内切酶都是5'突出的，也就是缩进去的那个free的是3’末端，这样就可以补平
但是对于3‘突出的限制性内切酶，缩进去的是5’末端，这个就不能继续用Klenow Fragment的正向反应了。
解决之道很简单，就是Klenow Fragment还有一个3‘-5’的核酸外切酶活性，就是不加dNTP，可以把5‘突出的切平。
专业干这活的是T4 DNA polymerase，活性比Klenow Fragment高很多，但是我一直就用Klenow也行。
我喜欢在切片之后再加点dNTP让它补平，因为切到平齐的时候实际上进行的是一个交换反应。

但是，如果你说酶切过夜，载体就没了，这个相当不正常。
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6楼2014-03-25 19:43:13
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-24 19:04:41
片段的双酶切用的是哪两个酶？看一下酶切后的粘性末端是5‘突出还是3’突出。还有就是一个转化子都不长，可能是去磷酸化很干净，或者有可能是感受态不好，建议做个不去磷酸化的线性质粒做连接、转化做阳性对照。
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2楼2012-12-18 12:23:31
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liuwei0824

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by zhaodahe at 2012-12-18 12:23:31
片段的双酶切用的是哪两个酶？看一下酶切后的粘性末端是5‘突出还是3’突出。还有就是一个转化子都不长，可能是去磷酸化很干净，或者有可能是感受态不好，建议做个不去磷酸化的线性质粒做连接、转化做阳性对照。

谢谢你O(∩_∩)O~
片段酶切用的是sacI和 salI，粘性末端5‘突出和3’突出会有很大的区别吗？
下次准备做不去磷酸化的对照，O(∩_∩)O~
但是这一次的实验还是很失败
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3楼2012-12-21 16:15:17
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zhaodahe

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★
小丹木木: 金币+2, 鼓励交流 2012-12-24 19:04:58
引用回帖:
3楼: Originally posted by liuwei0824 at 2012-12-21 16:15:17
谢谢你O(∩_∩)O~
片段酶切用的是sacI和 salI，粘性末端5‘突出和3’突出会有很大的区别吗？
下次准备做不去磷酸化的对照，O(∩_∩)O~
但是这一次的实验还是很失败...

粘性末端补平应该是用聚合酶孵化，而聚合酶大多是有方向性的，如果是3’粘性末端，好像是不行的，当然也要看你用的是什么聚合酶。
我刚查了一下，SacI是3‘粘性末端，你做不出结果，问题可能在这。
建议你还是换个酶切位点。
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4楼2012-12-24 12:35:12
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