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liuyu_sdili木虫 (正式写手)
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求助：一端为黏性末端一端为平末端的克隆 已有1人参与
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需要做一个一端为黏性末端一端为平末端的克隆，求教下面几个问题？ 1. 如果我用pfu扩增的话，那么是不是可以使用pfu扩增形成的平末端而不用加产生平末端的酶切位点？ 2. 我使用的两个限制酶都购自Takara，一个是SnaB I，另外一个是NotI，请问这两个酶使用时需要注意什么？ 3.酶是Fermentas的T4连接酶，说明书上是22℃反应，但是很多人用16℃跟4℃，请问那个效果好些？需要连接多长时间？像我这种情况是不是需要用平末端的连接条件（加入PEG）？ |
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liuyu_sdili
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mitocam
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需要做一个一端为黏性末端一端为平末端的克隆，求教下面几个问题？ 1. 如果我用pfu扩增的话，那么是不是可以使用pfu扩增形成的平末端而不用加产生平末端的酶切位点？ 理论上可以，但不知DNA聚合酶扩增时会不会丢失一两个碱基。可以试一试。 2. 我使用的两个限制酶都购自Takara，一个是SnaB I，另外一个是NotI，请问这两个酶使用时需要注意什么？ 没用过SnaBI，NotI是常用酶，按照说明书就行了。 用对buffer能否同时使用两个酶，他们的实用温度一样不？ 3.酶是Fermentas的T4连接酶，说明书上是22℃反应，但是很多人用16℃跟4℃，请问那个效果好些？需要连接多长时间？像我这种情况是不是需要用平末端的连接条件（加入PEG）？ 我用NEB的T4，通常25倍稀释在水中（短时间）用于连接，通常室温 23C过夜，如果着急，3－4小时也可以。我一直都有用PEG。 这种情况需要载体去磷酸化吗？ 不用。 |
3楼2012-08-16 21:26:10
qiaoxianying
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前两个月刚做过一平一粘的连接，和楼主分享一下。 1、pfu出来的就是平末端，所以个人觉得不需要在加入酶切位点。 2、takara上有关于两种酶的buffer选择问题，不过我没有找到SnaBI和NotI双酶切的相关资料。不过这两个酶切都需要加BSA的。 3、fermentas的T4 ligase22℃连接效果很好，我做的时候是使用22℃2个小时做的一平一粘的连接，加入PEG了的。再不行可以4℃过夜，再22℃连接2小时试试。 |
8楼2012-08-18 19:17:39
liuyu_sdili
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